不同增氧方式對(duì)鱘魚養(yǎng)殖水體微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響

朱開興　黃麗娥　饒秋華　宋永康　黃薇

摘 要：比較研究鱘魚養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)用微納米曝氣增氧機(jī)和水車式增氧機(jī)兩種增氧方式的效果，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同增氧方式對(duì)養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)和潛在病原微生物之間的影響，以及溶解氧濃度與潛在病原微生物相對(duì)豐度的相關(guān)性。結(jié)果表明：微納米曝氣增氧機(jī)和水車式增氧機(jī)增氧方式的鱘魚養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)基本一致，且兩種增氧方式下的鱘魚養(yǎng)殖水體中均檢測(cè)出9種潛在病原微生物（屬水平）。其中潛在病原微生物Acinetobacter、Aeromonas、Clostridium、Flavobacterium、Mycobacterium、Pseudomonas在微納米曝氣增氧機(jī)中的相對(duì)豐度要低于水車式增氧機(jī)的養(yǎng)殖水體，但差異不顯著（P≥0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，潛在病原微生物Parachlamydia、Rickettsia與養(yǎng)殖水體中的溶解氧濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：微納米曝氣增氧機(jī);水車式增氧機(jī);鱘魚養(yǎng)殖;微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S 965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）03-0011-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.03.003

Abstract： The effects of two oxygenation methods including micronano aerated aerator and waterwheel aerator in the process of sturgeon culture were compared and studied in this paper， and the highthroughput sequencing technology was used to analyze the effects of different oxygenation methods on the structure of dominant bacteria and potential pathogenic microorganisms in the aquaculture water， and the correlation between the concentration of dissolved oxygen and the relative abundance of potential pathogenic microorganisms was also analyzed. The results showed that the structure of dominant bacteria in the sturgeon aquaculture water under the micronano aerated aerator and the waterwheel aerator was basically the same， and nine kinds of potential pathogenic microorganisms （genus level） were detected in the sturgeon aquaculture water under the two kinds of aeration. Among them， the relative abundance of potential pathogenic microorganisms Acinetobacter， Aeromonas， Clostridium， Flavobacterium， Mycobacterium and Pseudomonas in the micronano aerated aerator was lower than that in the aquaculture water with waterwheel aerator. But the difference was not significant （P≥0.05）. The results of correlation analysis showed that the potential pathogenic microorganisms Parachlamydia and Rickettsia were significantly positively correlated with the dissolved oxygen concentration in the aquaculture water （P<0.05）.

Key words： Micronano aerated aerator; Waterwheel aerator; Sturgeon culture; Microbial community structure

養(yǎng)殖水體是水生動(dòng)物賴以生存的環(huán)境，對(duì)魚類的健康生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用[1-2]。養(yǎng)殖水域環(huán)境中生存著大量的細(xì)菌菌群，對(duì)于養(yǎng)殖疾病的控制與發(fā)生、水域環(huán)境的物質(zhì)代謝、水質(zhì)調(diào)控及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等起著重要的影響作用[3]。崔丙健等[4]認(rèn)為，存活于養(yǎng)殖環(huán)境中的病原菌盡管只占微生物群落的很少一部分，但在一定條件的刺激下會(huì)大量增殖，最終可能導(dǎo)致水產(chǎn)疾病的暴發(fā)流行。同時(shí)有研究顯示，魚病的發(fā)生幾率及發(fā)病類型與養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌數(shù)量呈顯著的正相關(guān)[5]。隨著研究的深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到理解養(yǎng)殖水體中的菌群結(jié)構(gòu)組成對(duì)于水生動(dòng)物的健康培育具有重要的指導(dǎo)意義。

鱘魚是地球上現(xiàn)存最古老的脊椎動(dòng)物，主要分布在北半球的北美洲大陸和歐亞大陸，其中我國(guó)是鱘鰉魚分布較多的國(guó)家[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)年產(chǎn)鱘魚約10萬(wàn)t，養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界鱘魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%以上[7-8]。在鱘魚養(yǎng)殖過(guò)程中，鱘魚對(duì)于水中的溶氧量要求與其他魚類相比較高，要求養(yǎng)殖水體中的溶氧量控制在5 mg·L-1以上。因此，在鱘魚人工養(yǎng)殖下，為了維持水中的溶解氧濃度，必須通過(guò)使用增氧設(shè)備裝置來(lái)提高溶解氧含量。近年來(lái)，主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中在傳統(tǒng)的葉輪式、水車式增氧機(jī)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了新型的微納米曝氣增氧技術(shù)，能夠顯著提高鱘魚養(yǎng)殖水體中溶解氧含量[9-10]。目前，關(guān)于不同增氧方式對(duì)鱘魚養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了深入研究鱘魚養(yǎng)殖水體的微生物群落結(jié)構(gòu)，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)等手段對(duì)微納米曝氣和水車式兩種增氧機(jī)的增氧效果以及其對(duì)鱘魚養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行分析，從而為鱘魚人工養(yǎng)殖技術(shù)開發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在福建省周寧縣福建龍?chǎng)m鱘業(yè)有限公司鱘魚養(yǎng)殖車間進(jìn)行，車間廠房為鋼架結(jié)構(gòu)，屋面與外墻采用隔熱保溫材料修建，魚池為磚砌水泥池，單池面積144 m2，養(yǎng)殖水體144 m3。試驗(yàn)分為2組，A組為微納米曝氣增氧機(jī)，B組水車式增氧機(jī)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)時(shí)選取放養(yǎng)密度一致、養(yǎng)殖條件一致、養(yǎng)殖品種相同的鱘魚。

1.2 水樣采集

樣品于2020年6月12日采集，利用500 mL含0.4 mg硫代硫酸鈉的無(wú)菌水樣采集袋采集水樣，將采集的水樣送實(shí)驗(yàn)室4℃保存，24 h內(nèi)完成DNA提取。樣品命名：微納米曝氣增氧機(jī)養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為A1、A2和A3，水車式增氧機(jī)養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為B1、B2和B3。

1.3 溶解氧測(cè)定

溶解氧（DO）采用美國(guó)哈希便攜式溶氧儀HQ30D測(cè)定。

1.4 基因組DNA提取

取養(yǎng)殖水體樣品各500 mL，利用0.45 μm濾膜富集水體中的微生物。富集好的微生物樣品采用水樣DNA提取試劑盒（MOBIO，美國(guó)）提取總基因組DNA，得到的DNA樣品用Qubit 2.0分光光度計(jì)（Invitrogen，美國(guó)）測(cè)定其濃度，之后將濃度≥50 ng·μL-1的樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和Illumina測(cè)序。PCR擴(kuò)增采用16S rRNA基因V3～V4區(qū)的通用引物341F和805R。

1.5 高通量數(shù)據(jù)處理

Illumina測(cè)序平臺(tái)得到的PE reads，首先采用overlop進(jìn)行拼接[11-12]，區(qū)分樣品后對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾[13]，然后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析[14-15];進(jìn)一步對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行檢測(cè)[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 增氧機(jī)增氧效果對(duì)比

表1為微納米曝氣增氧機(jī)和水車式增氧機(jī)的增氧效果比較。其中，動(dòng)力效率是指增氧機(jī)每瓶輸入功率每小時(shí)使氧氣在水中溶解的千克數(shù)，單位為kg·kW-1·h-1。在增氧能力上，微納米曝氣增氧比水車式增氧機(jī)增氧提高了22.22%;在增氧動(dòng)力效率上，前者是后者的1.22倍。

表1 不同增氧機(jī)增氧效果對(duì)比

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

表2為6個(gè)養(yǎng)殖水體樣品Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。從表2可知，每個(gè)樣品的OUT覆蓋率（Good′s coverage）均大于99%，表明本研究獲取的數(shù)據(jù)量能夠很好地反映特定樣品的細(xì)菌多樣性情況;6個(gè)樣品獲得的有效16S rRNA基因序列數(shù)為60067～74052條，共計(jì)414209條;基于97%的序列相似性，平均每個(gè)樣品獲得OTUs為412個(gè)。Alpha多樣性分析結(jié)果表明，微納米曝氣增氧機(jī)和水車式增氧機(jī)的Alpha多樣性指數(shù)（ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannoneven指數(shù)）的差異并不明顯，表明各樣品間的物種豐度和多樣性基本一致。

2.3 鱘魚養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

2.3.1 優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度 本研究共得到18個(gè)門水平的細(xì)菌（圖1）。從圖1可見(jiàn)，6個(gè)鱘魚養(yǎng)殖水體樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群類別基本相同，主要由Actinobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria和Proteobacteria組成，這4個(gè)門分別占到所有樣品序列總數(shù)的76.92%～94.87%。但差異顯著性分析結(jié)果顯示，這些門類的細(xì)菌在兩種增氧方式下養(yǎng)殖水體中的差異并不顯著（P≥0.05）。

在兩組鱘魚養(yǎng)殖水體樣品中，共檢測(cè)到227個(gè)屬的細(xì)菌，其中未分類的細(xì)菌菌屬達(dá)到65個(gè)。從分析結(jié)果（圖2）可以看出，養(yǎng)殖水體中豐度在2%以上的細(xì)菌屬主要有Cetobacterium（60.11±11.31）%、Mycobacterium（4.48±5.19）%、Litorilinea（3.88±6.39）%、Bacteroides（3.35±5.07）%、unclassified_Bacteria（3.04±3.74）%和Legionella（2.95±4.55）%。同時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，這些優(yōu)勢(shì)菌屬在兩組養(yǎng)殖水體中無(wú)顯著差異（P≥0.05），說(shuō)明在屬水平上，兩組養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌種類和組成相似。

2.3.2 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落組成比較分析 通過(guò)構(gòu)建韋恩圖來(lái)分析鱘魚養(yǎng)殖水體樣品中所共有的和特有的OTU數(shù)目（圖3）。圖3顯示，各養(yǎng)殖水體樣品中共有251個(gè)OTUs，A1、A2、A3、B1、B2、B3養(yǎng)殖水體中各含有特有的OTUs分別為6、1、1、5、1和1個(gè)，說(shuō)明兩組養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌種類是基本一致的。

2.3.3 潛在病原微生物群落及其與環(huán)境因子的關(guān)系 表3顯示的是兩組鱘魚養(yǎng)殖水體中潛在病原微生物在屬水平上的分布情況。水產(chǎn)動(dòng)物中常見(jiàn)的病原微生物主要包括Acinetobacter、Aeromonas、Chryseobacterium、Clostridium、Edwardsiella、Flavobacterium、Heliobacillus、Lachnospira、Leucothrix、Mycobacterium、Parachlamydia、Pseudomonas、Plesiomonas、Providencia、Thiothrix、Rickettsia和Vibrio等。從表4可以看出，在兩種增氧方式下的鱘魚養(yǎng)殖水體中均檢測(cè)出9種潛在病原微生物（屬水平），共檢測(cè)出10種潛在病原微生物。其中，潛在病原微生物Acinetobacter、Aeromonas、Clostridium、Flavobacterium、Mycobacterium、Pseudomonas在微納米曝氣增氧機(jī)中的相對(duì)豐度要低于水車式增氧機(jī)的養(yǎng)殖水體，但差異不顯著。相關(guān)性分析顯示，潛在病原微生物Parachlamydia和Rickettsia與養(yǎng)殖水體中的溶解氧濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

3 結(jié)論

在微納米曝氣增氧機(jī)和水車式增氧機(jī)兩種不同增氧方式下開展鱘魚養(yǎng)殖試驗(yàn)，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鱘魚養(yǎng)殖水體的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析增氧方式對(duì)養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)和潛在病原微生物之間的影響以及溶解氧濃度與潛在病原微生物相對(duì)豐度的相關(guān)性。

（1）兩種增氧方式下鱘魚養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)基本一致，優(yōu)勢(shì)菌門由Actinobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria和Proteobacteria組成，優(yōu)勢(shì)菌屬由Cetobacterium、Mycobacterium、Litorilinea、Bacteroides、unclassified_Bacteria和Legionella組成。

（2）在兩種增氧方式下的鱘魚養(yǎng)殖水體中共檢測(cè)出10種潛在病原微生物（屬水平）。其中，潛在病原微生物Acinetobacter、Aeromonas、Clostridium、Flavobacterium、Mycobacterium、Pseudomonas在微納米曝氣增氧機(jī)中的相對(duì)豐度要低于水車式增氧機(jī)的養(yǎng)殖水體，但差異不顯著。

（3）相關(guān)性分析顯示，潛在病原微生物Parachlamydia和Rickettsia與養(yǎng)殖水體中的溶解氧濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）