海洋青霉菌IMB17-009抗菌活性次級代謝產(chǎn)物研究

李芳，李嬌，李莎莎，郝曉萌，關(guān)艷，劉玉鳳，王保國，甘茂羅

·論著·

海洋青霉菌IMB17-009抗菌活性次級代謝產(chǎn)物研究

李芳*，李嬌*，李莎莎，郝曉萌，關(guān)艷，劉玉鳳，王保國，甘茂羅

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室（李芳、李嬌、李莎莎、郝曉萌、關(guān)艷、甘茂羅）；276800 山東日照，濟寧醫(yī)學院藥學院（劉玉鳳、王保國）

分離鑒定從紅樹林沉積物分離的海洋青霉菌 IMB17-009 產(chǎn)生的抗菌活性次級代謝產(chǎn)物。利用中壓柱色譜、凝膠柱色譜和 HPLC 等多種色譜分離方法對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，通過紫外可見光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，采用微量液體稀釋法評價化合物對革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌的抗菌活性。從青霉菌 IMB17-009 固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得11 個化合物，其結(jié)構(gòu)分別確定為 meleagrin（1）、glandicoline B（2）、roquefortine C（3）、2-(2-(1-吲哚-3-基)乙酰基)-L-苯基丙氨酸（4）、citreohybridonol（5）、andrastin A（6）、andrastin B（7）、macrophorin A（8）、purpurogemutantin（9）、desferricoprogen（10）和deferriferrichrome（11）?；衔?、3、8、9對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌或彎孢霉菌、交鏈孢菌、鐮孢菌和白念珠菌等真菌具有一定的抗菌活性，最低抑菌濃度為 8 ～ 64 μg/ml。化合物4為一新的天然產(chǎn)物。

海洋微生物； 青霉屬； 抗菌； 抗真菌； 分離純化

近年來，多重耐藥細菌、尤其是革蘭氏陰性耐藥菌的不斷出現(xiàn)和快速擴散對人類健康構(gòu)成了嚴重的威脅[1]。然而，進入 21 世紀以來，新型抗菌藥物研發(fā)速度明顯減慢。研發(fā)新型、有效的抗耐藥菌藥物成為全世界急需解決的重要問題[2]。微生物是抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的最重要來源。海洋由于高鹽、高壓、低光照、低溫等特殊生境條件，使得海洋微生物可能產(chǎn)生與陸地微生物結(jié)構(gòu)不同的產(chǎn)物，如生物堿、萜類、聚酮類等，這些產(chǎn)物不僅結(jié)構(gòu)新穎

而且活性多樣，有望成為藥物先導(dǎo)化合物的重要來源[3-5]。海洋真菌廣泛分布于從深海至極地冰川的廣闊海域，寄生于海底沉積物、各種海洋生物和有機物中，具有豐富的物種多樣性和代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性[6]。在過去幾年里，越來越多的新型真菌次級代謝產(chǎn)物逐漸被發(fā)現(xiàn)。海洋真菌產(chǎn)物具有多樣的生物活性，如抗細菌、抗真菌和抗腫瘤活性[7-9]。當前，海洋真菌隱藏的巨大次級代謝潛力尚未被充分挖掘，有待于進一步的深入研究。

在從海洋微生物篩選新活性次級代謝產(chǎn)物的過程中[10-13]，我們對三亞紅樹林采集的海洋沉積物樣品開展了海洋微生物的分離工作。通過活性篩選發(fā)現(xiàn)，分離得到的一株青霉屬真菌 IMB17-009，其發(fā)酵產(chǎn)物顯示較強的抗菌活性。通過對該菌株次級代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)的分離純化研究，從中分離鑒定了 11 個化合物，其結(jié)構(gòu)分別確定為 meleagrin（1）、glandicoline B（2）、roquefortine C（3）、2-(2-(1H-吲哚-3-基)乙?；?-l-苯基丙氨酸（4）、citreohybridonol（5）、andrastin A（6）、andrastin B（7）、macrophorin A（8）、purpurogemutantin（9）、desferricoprogen（10）和deferriferrichrome（11）。（圖1），其中化合物 1、3、8、9 顯示出顯著的抗細菌和抗真菌活性。本文報道該菌株的次級代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑1H、13C-NMR 譜利用 Bruker 600 MHz 核磁共振儀測定；LC-MS 分析利用安捷倫 LC-MSD-Trap/SL1100 系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；HPLC 制備色譜利用島津LC-20 液相色譜儀；中壓色譜利用 Flash 色譜儀；凝膠柱色譜填料 Sephadex LH-20 購自 GE Biosciences 公司；Capcell C18 MG II色譜柱（5 μm，10 mm × 250 mm）購自日本資生堂公司；YMC-Pack Ph 色譜柱（5 μm，10 mm × 250 mm）購自日本 YMC 公司；人工海鹽購自天津中鹽海洋生物公司。

圖1 青霉菌IMB17-009 分離得到的化合物

Figure 1 The isolated compounds fromsp. IMB17-009

1.1.2 培養(yǎng)基

⑴菌株發(fā)酵培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 37 g，人工海鹽30 g，去離子水1 L。

種子制備：PDB 培養(yǎng)基（馬鈴薯提取物 3 g，葡萄糖 20 g，人工海鹽 30 g，去離子水 1 L）。

固體發(fā)酵：大米固體培養(yǎng)基（糙米 70 g，蛋白胨 3 g，海鹽 3 g，去離子水100 ml）。

⑵檢定菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)公司；MH 培養(yǎng)基購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 菌株來源 菌株 IMB17-009 從三亞紅樹林（18°24'09.00''N，109°51'08.00''E）采集的海底沉積物樣品中分離獲得。該菌株 ITS 區(qū)域 DNA 序列（GenBank No. MW350016）與青霉屬婁地青霉菌（，GenBank No. MT544459.1）、雷斯青霉菌（，GenBank No. KF018471.1）等菌株具有較高的同源性，相似度均為 99.81%。根據(jù)菌株表型及 ITS 序列分析，將菌株 IMB17-009 確定為青霉菌屬菌株sp.，保存于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥微生物篩選實驗室。

1.1.4 活性檢定菌 枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、摩氏摩根菌（ATCC 25830）、白念珠菌（ATCC 10231）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；鐮孢菌（sp. CPCC 400381）、交鏈孢菌（sp. CPCC 400323）、彎孢霉菌（sp. CPCC 400186）由本所中國藥學微生物菌種保藏管理中心余利巖研究員課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵 將菌株 IMB17-009 孢子懸液接種于 PDA 培養(yǎng)基平板上，置于 28 ℃培養(yǎng) 7 d，用無菌竹簽取約 1 cm2的含菌瓊脂塊接種于裝有 100 ml PDB 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，28 ℃，200 r/min，培養(yǎng) 5 d 制作種子液。將種子液按 10%（v/v）的接種量，轉(zhuǎn)接于含 100 ml 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，共 30 瓶，28 ℃靜置培養(yǎng) 30 d。

1.2.2 提取分離 收集菌株 IMB17-009 固體發(fā)酵產(chǎn)物，依次用乙酸乙酯（6 L × 3）和甲醇（6 L × 3）進行超聲提取。將提取液分別回收溶劑后進行合并，得到提取物 40 g。將提取物進行 C18 中壓柱色譜（反相 C18 柱 520 g，49 mm × 460 mm）分離，依次用 10%、30%、50%、70%、100% 甲醇溶液進行梯度洗脫，每個梯度分別洗脫 3 L，回收溶劑得到 5 個餾分（F1～ F5）。

餾分 F2（2 g）經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析（2.3 cm × 110 cm，70% 甲醇洗脫），得到 12 個組分（F2-1～ F2-12）。組分 F2-6經(jīng) HPLC 色譜純化（Capcell C18 MG II，20% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物10（10 mg）和11（10 mg）。

餾分 F3（1.5 g）經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析（2.3 cm × 110 cm，90% 甲醇洗脫），得到 14 個組分（F3-1～ F3-14）。組分F3-6經(jīng) HPLC 色譜純化（Capcell C18 MG II，40% 乙腈-1‰ 甲酸水，4 ml/min），得到化合物1（25 mg）和5（14 mg）。組分 F3-7經(jīng) HPLC 色譜純化（Capcell C18 MG II，55% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min），得到化合物2（3 mg）。組分 F3-8經(jīng) HPLC 色譜純化（YMC-Pack Ph，33% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物4（5 mg）。

餾分 F4（5 g）經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析（2.3 cm × 110 cm，90% 甲醇洗脫），得到 13 個組分（F4-1～ F4-13）。組分 F4-4經(jīng) C18 中壓柱色譜（反相 C18 柱 40 g，30% ～ 100% 甲醇，30 min 梯度洗脫，10 ml/min）得到 12 個亞組分 F4-4-1～ F4-4-12。亞組分 F4-4-3～ F4-4-6合并，經(jīng) HPLC 純化（Capcell C18 MG II，70% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物6（5 mg）和7（4 mg）。組分 F4-6經(jīng) C18 中壓柱色譜（反相 C18 柱 40 g，40% ～ 100% 甲醇，60 min 梯度洗脫，10 ml/min）得到 11 個亞組分 F4-6-1～ F4-6-11。亞組分 F4-6-6～ F4-6-8合并，經(jīng) HPLC 純化（Capcell C18 MG II，60% 乙腈-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物3（5 mg）、8（3 mg）和9（2 mg）。

1.2.3 化合物4的立體構(gòu)型鑒定 稱取化合物4約 0.4 mg，溶解于 500 μl 的 6 mol/L HCl 中，110 ℃加熱水解 1 h，將反應(yīng)液減壓濃縮得到水解產(chǎn)物。將水解產(chǎn)物和L-苯丙氨酸標準品（1 mg）分別溶解于 120 μl 的水中，各自平均分成兩部分，分別加入 100 μl的 5-氟-2,4-二硝基苯基-L-亮氨酰胺（L-FDLA）或D-FDLA 的 1% 丙酮溶液，同時加入 20 μl 1 mol/L NaHCO3溶液，40℃加熱振蕩 1 h。待反應(yīng)液冷卻至室溫，依次加入 10 μl 2 mol/L HCl 和 100 μl 乙腈進行稀釋，離心過濾后用 LC-MS 進行檢測。檢測條件為：色譜柱 Capecell C18 MG II C18 5 μm，4.6 mm × 150 mm；流速 1 ml/min；A 流動相為 1‰ 甲酸水溶液，B 流動相為乙腈；0 ～20 min，5% ～ 100% B；20 ～ 25 min，100 % B，紫外檢測 230 nm 波長；柱溫箱 30 ℃。L-苯丙氨酸標準品L、D-FDLA 衍生物（460）的保留時間分別為 14.7 和 16.0 min?；衔?的L、D-FDLA衍生物保留時間分別為 14.7 和 15.9 min。因此，化合物4結(jié)構(gòu)中苯丙氨酸單元構(gòu)型確定為L型。

1.2.4 化合物活性測定

1.2.4.1 抗細菌活性測定 化合物抗菌活性最低抑菌濃度（MIC）采用微量二倍稀釋法測定[10, 14]。稱取待測化合物1 ～ 11及陽性對照藥利福平，溶解于 DMSO 中，配制濃度為 12.8 mg/ml 的樣品溶液。將各檢定菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上進行復(fù)蘇，挑取單菌落接種到 MH 培養(yǎng)基，于 37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)；待菌液600為 1.0 時，再次按 1%（v/v）轉(zhuǎn)接至 MH 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待600為 1.0 時，取 200 μl 菌液用 MH 培養(yǎng)基稀釋 3000 倍（菌濃度約為 5 × 105CFU/ml）備用。將上述稀釋好的菌液加入 96 孔板中，第一列每孔 198 μl菌液，其余各列每孔 100 μl。在第一列孔中加入 2 μl 樣品溶液，隨后進行二倍稀釋，分別得到以下 12 個濃度梯度：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 和 0.0625 μg/ml。每個樣品重復(fù) 3 個復(fù)孔。隨后將 96 孔板放入 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h，觀測細菌情況。最低抑菌濃度（MIC）定義為沒有肉眼可見的細菌生長所對應(yīng)的化合物濃度。

1.2.4.2 抗真菌活性測定 將各檢定菌株在 PDA 平板上復(fù)蘇 5 d，挑取單菌落接種于 PDB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)；待菌液600為 0.1 時，取出 100 μl 菌液用 PDB 培養(yǎng)基稀釋 50 倍（菌濃度約為 3 × 106CFU/ml）。將上述稀釋菌液加入 96 孔板中，采用微量二倍稀釋法測得化合物的最低抑菌濃度[15]，樣品濃度范圍為 0.03 ～64 μg/ml，以制霉菌素作為陽性對照藥。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)確定

化合物1：淡黃色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax230，350 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）7.61（dd，= 7.8，1.2 Hz，H-4），7.07（td，= 7.8，1.2 Hz，H-5），7.27（td，= 7.8，1.2 Hz，H-6），7.02（dd，= 7.8，1.2 Hz，H-7），5.39（s，H-8），8.29（s，H-15），7.90（s，H-18），7.42（brs，H-20），6.08（brs，H-22），5.06（d，= 17.4 Hz，H-23a），5.01（d，= 9.6 Hz，H-23b），1.29（s，H-24），1.32（s，H-25），3.75（s，1-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）103.2（C-2），54.0（C-3），128.5（C-3a），126.0（C-4），124.5（C-5），129.4（C-6），112.9（C-7），148.1（C-7a），110.7（C-8），144.3（C-9），160.8（C-10），126.4（C-12），167.0（C-13），108.6（C-15），127.3（C-16），137.7（C-18），131.8（C-20），43.5（C-21），144.3（C-22），113.7（C-23），23.7（C-24），24.0（C-25），65.6（1-OCH3）；ESIMS434 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 meleagrin數(shù)據(jù)[16]一致。因此，化合物1的結(jié)構(gòu)確定為 meleagrin。

化合物2：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax230，350 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）7.57（d，= 7.8 Hz，H-4），7.01（t，= 7.8 Hz，H-5），7.24（t，= 7.8 Hz，H-6），6.96（d，=7.8 Hz，H-7），5.36（s，H-8），8.26（s，H-15），7.84（s，H-18），7.34（s，H-20），6.10（brs，H-22），5.07（d，= 17.4，H-23a），5.00（d，= 10.2，H-23b），1.32（s，H-24），1.29（s，H-25）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）101.9（C-2），52.7（C-3），127.1（C-3a），124.2（C-4），122.1（C-5），127.8（C-6），111.5（C-7），148.3（C-7a），109.1（C-8），142.8（C-9），159.5（C-10），125.5（C-12），165.8（C-13），106.9（C-15），126.2（C-16），136.2（C-18），130.6（C-20），42.0（C-21），144.8（C-22），112.1（C-23），C-24（n.d.）29.3（C-25）；ESIMS420 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的glandicoline B數(shù)據(jù)[17]一致。因此，化合物2的結(jié)構(gòu)確定為 glandicoline B。

化合物3：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax206，239，323 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）5.70（s，H-5a），6.59（d，= 7.8 Hz，H-7），7.05（t，= 7.8 Hz，H-8），6.71（t，= 7.8 Hz，H-9），7.19（d，= 7.8 Hz，H-10），2.52（dd，= 12.0，6.0 Hz，Ha -11），2.43（t，= 12.0，Hb-11），4.04（m，H-11a），6.36（s，H-12），7.79（brs，H-15），7.31（brs，H-17），6.06（dd，= 16.8，10.8 Hz，H-19），5.13（dd，= 10.2，1.2，H-20a），5.10（dd，= 16.8，1.2，H-20b），1.01（s，H-21），1.14（s，H-22）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）168.4（C-1），121.7（C-3），160.1（C-4），79.3（C-5a），152.4（C-6a），110.1（C-7），130.0（C-8），119.5（C-9），126.1（C-10），130.2（C-10a），62.6（C-10b），38.4（C-11），59.9（C-11a），111.0（C-12），125.0（C-13），C-15（n.d.），132.8（C-17），42.1（C-18），145.2（C-19），114.8（C-20），23.4（C-21），23.0（C-22）；ESIMS390[M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 roquefortine C數(shù)據(jù)[18]一致。因此，化合物3的結(jié)構(gòu)確定為 roquefortine C。

化合物4：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax218，280 nm，1H-NMR（DMSO-6，600 MHz）4.24（dd，= 7.2，5.4 Hz，H-2），3.04（dd，= 13.2，5.4 Hz，H-3a），2.88（dd，= 13.2，7.2 Hz，H-3b），7.09（d，= 7.8 Hz，H-5），7.13（m，H-6），7.12（m，H-7），7.13（m，H-8），7.09（d，= 7.8 Hz，H-9），7.07（s，H-2'），7.40（d，= 7.8 Hz，H-4'），6.92（dd，= 8.4，7.8 Hz，H-5'），7.05（dd，= 7.8，7.8 Hz，H-6'），7.31（d，= 8.4 Hz，H-7'），3.49（m，H-8'）；13C-NMR（DMSO-6，600MHz）173.8（C-1），54.7（C-2），37.2（C-3），138.5（C-4），129.4（C-5），127.8（C-6），125.9（C-7），127.8（C-8），129.4（C-9），123.9（C-2'），108.7（C-3'），127.2（C-3'a），118.7（C-4'），118.3（C-5'），120.9（C-6'），111.2（C-7'），136.1（C-7'a），32.8（C-8'），170.0（C-9'）；ESIMS323 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙?；?-苯基丙氨酸數(shù)據(jù)一致[19]，通過 2D NMR 數(shù)據(jù)分析也進一步確定化合物4的平面結(jié)構(gòu)為 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙?；?-苯基丙氨酸。利用 Marfey's 方法[20-21]確定化合物4 中苯丙氨酰單元絕對構(gòu)型為L 構(gòu)型。因此，化合物4 的結(jié)構(gòu)確定為 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙?；?-L-苯基丙氨酸，該化合物作為天然產(chǎn)物是首次報道。

化合物5：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax215，278 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.13（ddd，= 14.4，5.4，2.4 Hz，H-1a），1.33（m，H-1b），1.72（m，H-2），4.64（dd，= 3.6，1.8 Hz，H-3），2.03（brs，H-5），4.86（m，H-6），3.24（d，= 14.4 Hz，H-7a），2.50（dd，= 14.4，4.2 Hz，H-7b），2.40（m，H-9），5.60（m，H-11），1.62（s，H-18），1.26（s，H-20），1.85（s，H-21），1.32（s，H-22），0.88（s，H-24），0.98（s，H-25），3.61（s，19-OCH3），2.03（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）22.1（C-1），23.0（C-2），77.5（C-3），35.4（C-4），56.3（C-5），79.6（C-6），38.2（C-7），43.3（C-8），53.1（C-9），45.1（C-10），123.3（C-11），139.1（C-12），57.3（C-13），71.2（C-14），192.4（C-15），114.8（C-16），197.0（C-17），6.3（C-18），171.9（C-19），17.7（C-20），20.4（C-21），24.4（C-22），181.6（C-23），22.7（C-24），26.5（C-25），172.0（CH3O），20.8（H3CO），52.1（19-OCH3）；ESIMS501 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的citreohybridonol 數(shù)據(jù)[22]一致。因此，化合物5的結(jié)構(gòu)確定為 citreohybridonol。

化合物6：淡黃色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax210，287 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.28（ddd，= 13.2，3.6，3.0 HzH-1a），0.98（ddd，= 13.2，13.2，3.6 Hz，H-1b），2.06（m，H-2a），1.59（m，H-2b），4.61（dd，= 3.0，3.0 Hz，H-3），1.84（dd，= 13.2，3.0 Hz，H-5），2.09（dd，= 13.8，4.8 Hz，H-6a），1.69（m，H-6b），3.07（ddd，= 13.2，13.2，4.2 Hz，H-7a），2.24（ddd，=13.2，3.0，

3.0 Hz，H-7b），2.15（m，H-9），5.36（s，H-11），1.58（s，H-18），1.15（s，H-20），1.75（dd，= 2.4，1.2 Hz，H-21），1.23（s，H-22），10.17（s，H-23），0.87（s，H-24），0.94（s，H-25），3.57（s，19-OCH3），2.04（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）28.9（C-1），24.4（C-2），79.1（C-3），38.0（C-4），49.5（C-5），17.9（C-6），33.5（C-7），42.9（C-8），54.8（C-9），53.5（C-10），123.1（C-11），137.8（C-12），57.6（C-13），69.1（C-14），190.6（C-15），113.3（C-16），201.2（C-17），6.6（C-18），172.3（C-19），16.1（C-20），20.1（C-21），19.9（C-22），207.1（C-23），21.6（C-24），27.1（C-25），172.4（CH3O），21.1（H3CO），52.0（19-OCH3）；ESIMS487 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 andrastin A 數(shù)據(jù)[23]一致。因此，化合物6的結(jié)構(gòu)確定為 andrastin A。

化合物7：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax215，288 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.10（m，H-1a），1.03（td，= 13.2，4.2 Hz，H-1b），2.26（m，H-2a），1.56（m，H-2b），4.67（t，=3.0 Hz，H-3），1.53（m，H-5），2.10（m，H-6a），1.50（m，H-6b），2.88（m，H-7a），2.12（m，H-7b），1.93（m，H-9），5.67（s，H-11），1.58（s，H-18），1.17（s，H-20），1.76（m，H-21），1.33（s，H-22），3.92（d，= 12.0 Hz，H-23a），3.78（d，= 12.0 Hz，H-23b），0.89（s，H-24），0.99（s，H-25），3.55（s，19-OCH3），2.04（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）30.2（C-1），25.6（C-2），80.0（C-3），37.4（C-4），50.4（C-5），18.4（C-6），34.2（C-7），42.9（C-8），55.0（C-9），43.2（C-10），126.7（C-11），134.8（C-12），58.0（C-13），69.2（C-14），C-15（186.2），113.6（C-16），C-17（n.d.），6.5（C-18），172.4（C-19），16.1（C-20），20.0（C-21），18.1（C-22），62.6（C-23），21.5（C-24），28.4（C-25），172.7（CH3O），21.2（H3CO），51.9（19-OCH3）；ESIMS489 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 andrastin B數(shù)據(jù)[23]一致。因此，化合物7的結(jié)構(gòu)確定為 andrastin B。

化合物8：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax202，236 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）1.76（m，H-1a），1.22（td，= 13.2，4.2 Hz，H-1b），1.62（qt，= 13.8，3.6 Hz，H-2a），1.51（qt，= 13.8，3.6 Hz H-2b），1.41（brd，= 13.2 Hz，H-3a），1.25（td，= 13.2，4.2 Hz，H-3b），1.16（dd，= 13.8，3.6 Hz，H-5），1.76（m，H-6a），1.32（dd，= 12.6，4.2 Hz，H-6b），2.36（m，H-7a），1.95（td，= 13.2，5.4 Hz，H-7b），1.76（m，H-9），2.36（m，H-11a），1.85（dd，= 14.4，10.8 Hz，H-11b），4.80（m，H-12a），4.60（m，H-12b），0.73（s，H-13），0.83（s，H-14），0.88（s，H-15），5.94（d，= 1.8 Hz，H-2'），4.59（s，H-4'），3.70（d，= 3.0 Hz，H-5'），4.30（d，= 18.0 Hz，H-7'a），4.26（d，= 18.0 Hz，H-7'b）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）40.0（C-1），20.4（C-2），43.3（C-3），34.5（C-4），56.9（C-5），25.7（C-6），39.3（C-7），150.6（C-8），52.9（C-9），40.7（C-10），22.1（C-11），107.4（C-12），34.1（C-13），22.1（C-14），15.0（C-15），195.5（C-1′），120.3（C-2'），161.2（C-3'），66.2（C-4'），62.3（C-5'），61.3（C-6'），62.2（C-7'）；ESIMS361 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 macrophorin A數(shù)據(jù)[24]一致。因此，化合物8的結(jié)構(gòu)確定為 macrophorin A。

化合物9：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax202，240 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）1.78（m，H-1a），1.22（m，H-1b），1.62（m，2a），1.51（m，H-2b），1.40（m，H-3a），1.23（m，H-3b），1.18（td，= 13.2，3.6 Hz，H-5），1.78（m，H-6a），1.31（m，H-6b），2.44（m，H-7a），2.12（td，= 13.8，5.4 Hz，H-7b），2.02（m，H-9），2.22（d，=15.6 Hz，H-11a），2.02（m，H-11b），4.90（s，H-12a），4.59（s，H-12b），0.89（s，H-13），0.83（s，H-14），0.76（s，H-15），6.15（s，H-2'），3.85（s，H-5'），4.41（dd，= 18.0，1.8 Hz，H-7'a），4.34（dd，= 18.0，1.8 Hz，H-7'b），3.09（d，= 17.4 Hz，H-8'a），2.87（d，= 17.4 Hz，H-8′b）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）39.9（C-1），20.3（C-2），43.3（C-3），34.6（C-4），57.0（C-5），25.7（C-6），39.4（C-7），150.3（C-8），51.2（C-9），41.4（C-10），23.2（C-11），108.3（C-12），34.0（C-13），22.1（C-14），15.3（C-15），193.5（C-1'），120.8（C-2'），165.5（C-3'），71.8（C-4'），75.3（C-5'），86.5（C-6'），60.9（C-7'），43.5（C-8'），169.9（C-9'）；ESIMS419 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 purpurogemutantin 數(shù)據(jù)[24]一致。因此，化合物9 的結(jié)構(gòu)確定為 purpurogemutantin。

化合物10：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax220 nm；1H-NMR（DMSO-6，600 MHz）3.81（m，H-2，2'），8.13（s，2N-H，2'N-H），1.68（m，H-3，3'），1.60（m，H-3，3'，4，4'），3.49（m，H-5，5'），9.74（s，5N-OH，5'N-OH），6.22（s，H-7，7'），2.02（8-CH3），2.39（t，= 6.6 Hz，H-9），4.17（m，H-10，12），8.27（d，= 7.2 Hz，12N-H），1.54 ～ 1.66（m，H-13，14），3.49（m，H-15），9.74（s，15N-OH），6.22（s，H-17），2.02（18，8'-CH3），2.23（t，= 6.6 Hz，H-19，9'），3.53（t，= 7.8 Hz，H-20，10'），4.56（s，20-OH，10'-OH），1.84（s，CH3CO）；13C-NMR（DMSO-6，600 MHz）167.9（C-1，1'），53.9（C-2，2'），30.4（C-3，3'），22.2（C-4，4'），46.8（C-5，5'），166.6（C-6，6'），117.2（C-7），148.7（C-8），18.1（8-CH3），40.1（C-9），62.4（C-10），172.2（C-11），52.0（C-12），28.1（C-13），23.1（C-14），46.4（C-15），166.3（C-16），116.2（C-17，7'），151.0（C-18，8'），43.9（C-19，9'），59.2（C-20，10'），169.7（CH3O），22.2（H3CO），18.3（18，8'-CH3）；ESIMS769 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 desferricoprogen 數(shù)據(jù)[25]一致。因此確定化合物10的結(jié)構(gòu)為 desferricoprogen。

化合物11：黃色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax218 nm；H-NMR（CD3OD，600 MHz）4.43（dd，= 9.6，4.2 Hz 1H），4.33（dd，= 9.6，4.2 Hz，1H），4.22（dd，= 7.2，4.2 Hz，1H），4.17（d，= 16.2 Hz，1H），4.03（d，= 16.2 Hz，1H），4.01（d，= 16.2 Hz，1H），3.79（d，= 16.2 Hz，1H），3.76（d，= 16.2 Hz，1H），3.73（1H，=16.2 Hz，1H），3.68（m，3H），3.62（m，3H），2.10（m，9H），2.02（m，1H），1.65-1.92（m，11H）；13C-NMR（CD3OD，600MHz）174.6，174.6，174.5，173.8（2C），173.7，172.7，172.1，172.1，55.6，55.4，54.6，48.4（3C），44.3，44.0，43.6，30.3，29.9，28.8，24.6，24.3，24.2，20.4，20.3；ESIMS688.2 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的 deferriferrichrome 數(shù)據(jù)[26]一致。因此，化合物11的結(jié)構(gòu)確定為 deferriferrichrome。

2.2 抗菌活性

應(yīng)用微量二倍稀釋法對化合物1～ 11的抗菌活性進行評價，包括革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和摩氏摩根菌等細菌以及白念珠菌、彎孢霉菌、交鏈孢菌、鐮孢菌等真菌。結(jié)果顯示（表 1），化合物1、3和9對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌具有一定的抗菌活性，MIC 為 32 ～ 64 μg/ml?；衔?對枯草芽孢桿菌等細菌的抑制作用較弱，但對白念珠菌以及植物內(nèi)生真菌彎孢霉菌、交鏈孢菌和鐮孢菌等真菌顯示出較強的抑制活性，MIC 為 8 ～ 64 μg/ml。此外，化合物3和9對白念珠菌也具有一定的抑制活性，MIC 分別為 64、16 μg/ml。其余化合物對所有菌株均沒有抑制活性（MIC > 64 μg/ml）。

表 1 青霉菌 IMB17-009 分離化合物抗菌活性（μg/ml）

注：nt：沒有測定。

Note: nt: not test.

3 討論

本研究從紅樹林來源青霉菌 IMB17-009 固體發(fā)酵產(chǎn)物分離得到 11 個化合物，化合物4為一新的天然二肽產(chǎn)物。從中分離的兩個吲哚生物堿 meleagrin（1）和 roquefortine C（3）以及兩個混源倍半萜類化合物 macrophorin A（8）和 purpurogemutantin（9）均顯示出一定的抗革蘭氏陽性菌和抗真菌活性，其中化合物9的抗菌活性為本文首次報道。化合物2為 meleagrin 的 1 位N-羥基衍生物，盡管有文獻報道該化合物具有一定的抗菌活性[17]，但在本研究中未顯示出顯著的抗細菌和真菌活性（MIC > 128 或 64mg/ml），提示1 位 N-甲氧基脫甲基化會導(dǎo)致活性降低。文獻報道 meleagrin 能夠抑制烯酰?；d體蛋白還原酶（FabI），影響細菌脂肪酸合成，除作用于 FabI 外，其抗菌活性可能還與其他靶點有關(guān)[16]。本研究結(jié)果表明，海洋來源真菌能夠產(chǎn)生化學結(jié)構(gòu)多樣性的抗菌活性產(chǎn)物，在新型抗菌藥物先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)中具有巨大的潛力。

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Antimicrobial secondary metabolites from the marine-derivedsp. IMB17-009

LI Fang, LI Jiao, LI Sha-sha, HAO Xiao-meng, GUAN Yan, LIU Yu-feng, WANG Bao-guo, GAN Mao-luo

Author Affiliations:Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (LI Fang, LI Jiao, LI Sha-sha, HAO Xiao-meng, GUAN Yan, GAN Mao-luo); School of Pharmacy, Jining Medical College, Shandong 276800, China (LIU Yu-feng, WANG Bao-guo)

To identify the antimicrobial secondary metabolites from the marine-derivedsp. IMB17-009 isolated from the mangrove sediments collected at Sanya.The extracts from the solid rice fermentation cultures were isolated and purified by a combination of C18 reversed-phase flash chromatography, gel column chromatography and HPLC. Their structures were determined by spectroscopic analyses. Antimicrobial assays were performed by using the micro-broth dilution assay.11 compounds were isolated from the solid fermentation extracts ofspIMB17-009. Their structures were identified as meleagrin (1), glandicoline B (2), roquefortine C (3), 2-(2-(1-indol-3-yl)acetyl)-L-phenylalanine (4), citreohybridonol (5), andrastin A (6), andrastin B (7), macrophorin A (8), purpurogemutantin (9), desferricoprogen (10), and deferriferrichrome (11).Compound 1, 3, 8, and 9 shows antimicrobial activity against Gram-positive bacteriaandor the fungisp.,sp.,sp., andwith MIC values ranging from 8 - 64 μg/ml. Compound 4 is identified as a new natural product.

marine-derived microorganism;sp.; antibacterial; antifungal; isolation and purification

s:GAN Mao-luo, Email: ganml@imb.pumc.edu.cn; WANG Bao-guo, Email: bjr20081001@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.001

國家自然科學基金（81872781）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09711001-007-002）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-2-002）；濟寧醫(yī)學院青年教師科研扶持基金（JY 2016KJ003Z）

甘茂羅，Email：ganml@imb.pumc.edu.cn；王保國，Email：bjr20081001@163.com

2020-12-21

*同為第一作者