基于PCA和聚類分析方法對云南不同茶區(qū)曬青毛茶生化成分分析

楊雪梅,劉瑩亮,李家華,王智慧,趙建銳,李 梅,*

(1.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院,云南普洱665099; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院,云南昆明 650201)

云南大葉種曬青毛茶是以云南地理區(qū)域范圍內(nèi)大葉種茶樹鮮葉為原料,經(jīng)殺青、揉捻、日光干燥后制成的普洱茶原料[1-2],其品質(zhì)化學(xué)成分主要有茶多酚類、游離氨基酸類、生物堿類、茶多糖類、色素類、皂苷及一些香氣物質(zhì)[3-5]。茶葉的品質(zhì)與內(nèi)含成分的構(gòu)成比例密切相關(guān)[6]。但由于云南地理區(qū)域環(huán)境差異大,導(dǎo)致不同茶區(qū)曬青毛茶的品質(zhì)不同。其次,曬青毛茶在加工過程中,其內(nèi)在的化學(xué)成分在一定溫度、氧化酶的作用下會發(fā)生水解、聚合等變化,這些變化很大程度上影響了茶葉的香氣、滋味及色澤。茶多酚中黃烷醇(兒茶素)類化合物是形成茶葉色香味的主要成份之一,也是茶葉中有保健功能的主要成份之一[7-8]。其中,云南大葉種的黃烷醇類相比小葉種含量較高,表兒茶素沒食子酸脂含量接近甚至高于表沒食子兒茶素沒食子酸脂,并含有較多的簡單兒茶素(如兒茶素和表兒茶素),其含量往往也高于表沒食子兒茶素[9-10],這是云南大葉種區(qū)別于其它茶樹品種的典型特征。

近年來,隨著人們對普洱茶品質(zhì)的追求,很多學(xué)者對普洱茶品質(zhì)化學(xué)的研究不斷深入,但是目前學(xué)者主要研究是普洱茶的倉儲環(huán)境、時間等影響因子與品質(zhì)之間的相關(guān)性[11-13]。對云南不同茶區(qū)曬青毛茶品質(zhì)的研究鮮有報道[14-15]。故本文擬采用高效液相色譜法測定了云南不同茶區(qū)28份曬青毛茶的主要生化成分;利用主成分分析方法和聚類分析方法進(jìn)行類群劃分和生化成分分析。旨在通過了解曬青毛茶生化成分含量特點以及類群之間的差異性,為普洱茶產(chǎn)品的復(fù)配技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗茶樣選用2017年月采制的28份曬青毛茶(如表1) 由勐海臻味號茶葉股份有限公司提供,茶樣采制標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉,毛茶加工工藝基本按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；茚三酮 中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站;氯化亞錫 天津市化學(xué)試劑三廠;磷酸、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉 天津市雙船化學(xué)試劑廠;乙醇95% 汕頭市西隴化工廠有限公司;以上試劑均為分析純;甲醇、乙腈 美國安捷倫有限公司,色譜純。

表1 供試茶樣一覽表Table 1 Detail information of tea samples

BS201S數(shù)顯電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;TGL-16G高速臺式離心機 上海醫(yī)用儀器分析廠;IEC高速冷凍離心機 Thermo Electron corporation;NEX純水儀 普析通用;KS-250D超聲波清洗儀 寧波海曙科超聲設(shè)備公司;101-3ABS恒溫電熱干燥箱 北京市用光明醫(yī)療儀器廠;X-5紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;DFD-700數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;1200HPL高效液相色譜 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚的測定方法 按GB/T 8313-2002方法進(jìn)行測定[16]。分別用移液管精確取2 mL供試品溶液至10 mL離心管中,加入2 mL酒石酸鐵溶液、6 mL pH=7.5的磷酸緩沖液,搖勻離心,吸取上清液,置于紫外/可見分光光度計中測定吸光度,并按下式計算茶多酚含量。

茶多酚(%)=(吸光度×3.913/1000)×(總試劑的量/取試劑的量×試樣干物重)×100

1.2.2 游離氨基酸的測定方法 按GB/T 8314-2013方法進(jìn)行測定[17]。吸取茶湯提取液1 mL,置于25 mL容量瓶中,再加0.5 mL磷酸鹽緩沖液,加2%茚三酮水溶液0.5 mL,在沸水浴中加熱15 min,冷卻后,加水定容至25 mL,放置5～10 min,置于紫外/可見分光光度計中測定吸光度,并按下式計算游離氨基酸含量。

游離氨基酸總量(10 μg.g-1)=[(A×0.57)/1000×稀釋倍數(shù)/樣品干物重]

注:稀釋倍數(shù)為制備茶湯時所用容量瓶的體積500 mL。

1.2.3 兒茶素類、咖啡堿的測定方法 參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行測定[18-19]?；鞓?biāo)樣的配制:每個標(biāo)樣稱10 mg(準(zhǔn)確至0.01 g),用70%甲醇溶解,定容至10 mL,0.22 μm膜過濾得1 mg/mL標(biāo)品;每個標(biāo)樣各取1 mL定容至10 mL,混合成0.1 mg/mL混標(biāo)。

供試樣品的制備:稱取茶樣(磨碎)50 mg,先加入2%磷酸10 mL之后加10 mL甲醇(色譜純),混合后靜置1 h,用0.45 μm有機膜進(jìn)行過濾,再進(jìn)入液相色譜儀檢測。重復(fù)3次取平均值記結(jié)果。

1.2.4 含水量的測定方法 參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行測定[20]。將潔凈的烘皿連同蓋置于(103±2) ℃的干燥箱內(nèi)加熱1 h,加蓋取出,于干燥器內(nèi)冷卻至室溫,稱量(準(zhǔn)確至 0.001 g)。稱取5 g試樣于已知質(zhì)量的烘皿中,置于(103±2) ℃干燥箱內(nèi)加熱4 h,加蓋取出,于干燥器內(nèi)冷卻至室溫,稱量。再置于干燥箱中加熱1 h,加蓋取出,于干燥器內(nèi)冷卻,稱量。重復(fù)加熱1 h 的操作,直至連續(xù)2次稱量差不超過0.005 g,即為恒重,以最小稱量為準(zhǔn)。

水分含量(%)=(m1-m2)/m0×100

式中:m1-試樣和烘皿烘前的質(zhì)量,g;m2-試樣和烘皿烘后的質(zhì)量,g;m0-試樣的質(zhì)量,g。

1.2.5 水浸出物的測定方法 按GB/T 8305-2002方法進(jìn)行測定[21]。稱量2 g(精確到 0.001 g)磨碎試樣于500 mL錐形瓶,加沸蒸餾300 mL,立即移入沸水浴中浸提45 min(每隔10 min搖動一次),趁熱過濾。用150 mL沸蒸餾水洗滌茶渣數(shù)次,將茶渣連同已知質(zhì)量的濾紙移入鋁盒內(nèi),然后移入(120±2) ℃的恒溫干燥箱內(nèi)烘1 h,加蓋取出冷卻1 h再烘1 h,立即移入干燥器內(nèi)冷卻至室溫,稱量。

水浸出物含量(%)=(1-m1/(m0×w))×100

式中:m0-試樣質(zhì)量,g,m1-干燥后的茶渣質(zhì)量,g,w-試樣干物質(zhì)含量(%)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 生化成分分析

表4是28份大葉種茶樹曬青毛茶主要生化成分的測定結(jié)果,曬青毛茶生化成分是影響茶葉口感滋味和香氣變化的重要物質(zhì)基礎(chǔ),同時也是茶葉拼配需要考察的重要因素。從表4顯示,28份實驗樣品中氨基酸、咖啡堿、兒茶素多樣性指數(shù)和變異系數(shù)都較高,說明實驗樣品間這些成份存在明顯差異;10個指標(biāo)中多樣性指數(shù)最大的為兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸脂,其中,兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸脂變異系數(shù)較大,說明3種生化成分在測試的供試樣中相比其它成分有較大不同,多樣性較廣泛,也說明了云南大葉種茶樹以非酯型兒茶素組成及表現(xiàn)上更加豐富。

表4 參試材料主要生化成分基本統(tǒng)計參數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)Table 4 The basic statistical of test material in biochemical composition and genetic diversity index

表5是7種生化成分存在較大差異的供試樣分析結(jié)果。從表5可知,在茶葉4項常規(guī)成分中雙江縣勐庫春供試樣的茶多酚和水浸出物含量最高,分別達(dá)38.72%和55.56%,而在云縣白鶯山春供試樣的茶多酚含量最低,僅為19.80%;景谷縣黃草壩春供試樣中含氮化合物氨基酸和咖啡堿的含量最大,含量分別達(dá)6.42%和4.70%,云縣白鶯山春供試樣的咖啡堿含量最少為1.82%,易武彎弓春供試樣的氨基酸含量最低為3.26%。從兒茶素組分的含量可知,景谷縣黃草壩春供試樣中表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸脂和總量都遠(yuǎn)大于其他6個供試樣。從酯型兒茶素占兒茶素總量的含有率可知,除易武彎弓春和老班章春2個供試樣中酯型兒茶素占兒茶素總量的含有率大于70%以外,其余5個供試樣都≤50%。表現(xiàn)出了云南茶樹種質(zhì)資源原始性的特點。

表5 生化成分存在較大差異的茶樣間組分比較Table 5 Analysis of major biochemical composition of tea samples with large difference

2.2 主成分分析

表6是28份實驗樣品中主要生化成分進(jìn)行主成分分析,得到4個主成分(Z1～Z4),累計貢獻(xiàn)率達(dá)87.20%。

表6 主成分特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalue,proportion and cumulative proportion obtained by PCA

從表6和表7可知,主成分Z1貢獻(xiàn)率是26.56%,主要反映EGCG、C、GA、EGCG+EGC、EGCG+ECG 5個兒茶素類的信息,其中C的向量系數(shù)為0.985,酯型兒茶素的系數(shù)為0.791。主成分Z2貢獻(xiàn)率是21.12%,主要反映了GA(沒食子酸)、TP(茶多酚)、TCC(兒茶素總量)和咖啡堿的信息,TP和TCC的系數(shù)值分別為0.926和0.955。主成分Z3貢獻(xiàn)率是20.62%,主要反映EGC、EC、GA、EGC+EC的信息,其中非酯型兒茶素的系數(shù)為0.963。主成分Z4貢獻(xiàn)率是18.91%,主要反映ECG、EC、C、EGCG+ECG、ECG+EC和氨基酸的信息,氨基酸在分析中的最大系數(shù)僅為0.425,說明氨基酸在茶樹分類中的貢獻(xiàn)不是太明顯,其中鄰苯二酚型兒茶素的系數(shù)為0.991,反映的是較原始的古茶樹信息。表7標(biāo)示出的值均賦予了該主成分很高的正相關(guān)性,表現(xiàn)出較大的貢獻(xiàn)并反映出該項因子在分析中的較大依存性。

表7 主成分特征向量Table 7 Eigenvectors of PCA

2.3 聚類分析

聚類分析結(jié)果如圖1所示,28份來自不同區(qū)域的實驗樣品被分為了6個類群,其中A類群主要分布地為滇南,包括雙江勐庫在內(nèi)的8個實驗樣品,該類群的特點是茶多酚含量均大于31%,ECG含量都大于4.5%,除冰島和布朗山大寨,其它材料的ECG含量均高于EGCG,表現(xiàn)出了云南大葉種兒茶素含量的特點。B類群主要分布地在滇西南,包括黃草壩、大樹山在內(nèi)的材料5份,該類群表現(xiàn)出了氨基酸含量高的特點,除勐海邦盆略低外組內(nèi)其它材料均大于5.5%,咖啡堿含量均值3.63%,兒茶素總量均值20.46%,其中C、EGCG含量都顯著高于其它類群。C類群主要分布于版納茶區(qū),包括勐海勐宋在內(nèi)的3份材料,3份材料的EC含量大于3%,超過其它類群。D類群主要分布于勐海,包括布朗山帕亮在內(nèi)的5份材料,D類群茶多酚含量大于30%,其中ECG含量均值3.68%、EGCG含量均值3.99%,兩者含量上很接近,而且該群EGC含量顯著高于其它類群含量,最大的是勐海老曼娥達(dá)到3.86%,表現(xiàn)出了資源原始性的特點。E類群僅云縣白鶯山材料1份,在所有材料中兒茶素總量、咖啡堿、水浸出物及茶多酚含量最低,但氨基酸含量最高,推測該茶可能為野生種。F類群主要分布地在勐臘地區(qū),包括易武一扇磨春茶在內(nèi)的材料6份,該類群茶多酚含量30%左右,但兒茶素總量最少,僅EGCG、ECG含量略高外其它成分顯著較少。另外B、C、D類群的水浸出物含量明顯高于其它類群。上述分析結(jié)果可反映出云南大葉種茶樹資源廣泛,存在較大變異、且原始性的特點。

圖1 聚類分析圖Fig.1 Cluster diagram

3 結(jié)論

28份曬青毛茶樣中氨基酸、咖啡堿、兒茶素多樣性指數(shù)和變異系數(shù)都較高,說明供試茶樣中的生化成份存在明顯差異;10個生化指標(biāo)中多樣性指數(shù)最大的為兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸脂,分別是1.91、1.91、1.97、1.90。其中,又以兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素變異系數(shù)較大,分別為56.88%、36.41%和49.52%,說明三種生化成分在測試的供試樣中相比其它成分有較大不同,多樣性較廣泛,也說明了云南大葉種茶樹以非酯型兒茶素組成及表現(xiàn)上更加豐富。通過聚類分析將供試樣劃分為6個類群,并且類群之間生化成分含量存在一定差異。說明云南大葉種茶樹資源廣泛,存在較大變異、且原始性的特點。因此,可為普洱茶產(chǎn)品的復(fù)配技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐,也為消費者合理、正確選擇普洱茶產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。