白及清肺養(yǎng)胃口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

□ 王勇 張志勇 貴州省食品藥品檢驗(yàn)所

□ 張炯怡 宋曉寧 李松 李靜鋒 貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院

白及為蘭科白芨屬植物，英文名為Bletillae Rhizoma，拉丁種名為Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.，主產(chǎn)于貴州、四川、浙江、湖南等省份，為多年生草本植物?！吨袊幍洹?020版一部指出，白及具有收斂止血、消腫生肌等功效[1]?！侗静輩R言》論述“白及斂氣，止血，消癰之要藥也。此藥極粘膩，癰腫可消，潰敗可托，有托舊生新之妙用也?！庇纱丝梢?，白及既有助于止血消癰，還具有封填破損、托舊生新的組織修復(fù)功能。白及的用藥歷史悠久，應(yīng)用廣泛，藥效顯著，目前已分離出聯(lián)芐類、菲類、黃酮類、苯丙素類、甾體、三萜等成分[2]。此外，白及是傳統(tǒng)止血生肌的重要藥材，臨床用于消化道潰瘍和出血的效果顯著?，F(xiàn)代研究表明，白及多糖是白及中的主要有效成分——可通過黏附作用在胃黏膜表面形成一層保護(hù)膜，起到保護(hù)和修復(fù)潰瘍面的作用[3]。鞏子漢[4-6]等研究表明，白及多糖可通過下調(diào)PI3K及Akt mRNA和蛋白表達(dá)水平來抑制細(xì)胞因子IL-2R及IL-4的異常分泌，通過下調(diào)JNK 及P38 MAPK基因和蛋白表達(dá)水平來抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6的異常分泌；通過下調(diào)模型大鼠血清IL-2R、上調(diào)IL-4含量和胃組織Caspase-8表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。除此之外，白及還具有其他多種藥理作用，如抗菌、抗胃潰瘍、抗氧化等[7-11]。本課題組以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，按照保健食品的配方要求，研制出白及清肺養(yǎng)胃口服液，并以《保健食品行政許可受理審查要點(diǎn)》中保健食品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求對(duì)本品進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，旨在為白及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Linomat-5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、REPROSTAR 3薄層色譜成像系統(tǒng)（CAMAG）；GZX-9030MBE型電熱恒溫古風(fēng)干燥箱；超純水機(jī)；薄層層析硅膠G板，青島海洋化工廠；UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；AE-240型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DFD 700數(shù)顯恒溫水浴鍋；Mettler AE-240型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 材料

白及對(duì)照藥材，批號(hào)：AF20021021；乙腈（色譜純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮、硫酸、甲醇、無水乙醇等，均為分析純；白及口服液，實(shí)驗(yàn)室自制；D-無水葡萄糖對(duì)照品；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品為口服液，內(nèi)容物為黃褐色粘稠液體。

2.2 薄層鑒別

鑒別①為制劑中白及藥材的薄層色譜鑒別。取樣品醇沉，過濾，濾液蒸發(fā)至近干，加水復(fù)溶，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層作為供試品溶液。取白及對(duì)照藥材用70%乙醇超聲提取后照供試品制備方法制備對(duì)照藥材溶液，另取不含白及藥材的陰性制劑作為陰性對(duì)照溶液。分別吸取上述溶液點(diǎn)涂于薄層層析硅膠G板上，使其呈條帶狀，分別以甲醇-乙酸乙酯-環(huán)己烷（1.5∶2.5∶6）、甲苯-甲醇（5∶1）、甲苯-甲醇（9∶1）、甲苯-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑展開，取出并晾干，以10%的硫酸乙醇溶液作為顯色劑向板上噴灑，加熱（105℃）至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，以甲苯-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑的展開分離效果較好，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 白及的TLC鑒別

鑒別②為制劑中酸漿藥材的薄層色譜鑒別。試驗(yàn)考察了制劑未萃取和萃取后采用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取的薄層色譜鑒別效果，發(fā)現(xiàn)采用乙酸乙酯萃取后樣品的展開效果良好，故選擇乙酸乙酯萃取，并取乙酸乙酯層作為供試品溶液。陰性對(duì)照溶液以不含酸漿藥材的陰性制劑同法制備，對(duì)照藥材溶液以酸漿藥材加甲醇超聲提取制備。分別吸取上述溶液點(diǎn)涂于薄層層析硅膠G板上，使其呈條帶狀，分別以甲醇-乙酸乙酯-環(huán)己烷（1.5∶2.5∶6）、三氯甲烷-丙酮-甲醇（25∶1∶1）、甲苯-甲醇（5∶1）、甲苯-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑展開，取出并晾干，以10%的硫酸乙醇溶液作為顯色劑向板上噴灑，加熱（105℃）至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，以甲苯-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑的展開色譜斑點(diǎn)分離好，顯色清晰，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 酸漿的TLC鑒別

2.3 重金屬檢查

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測(cè)定》（GB 5009.12-2017）第一法：石墨爐原子吸收光譜法、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》（GB 5009.15-2014）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》（GB 5009.11-2014）第一篇第二法：氫化物發(fā)生原子熒光法、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》（GB 5009.17-2014）第一篇第二法：冷原子吸收光譜法對(duì)樣品中鉛、鎘、總砷、總汞的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定結(jié)果（mg/kg，n=2）

2.4 多糖含量測(cè)定

現(xiàn)代研究表明，白及含有多類小分子化合物，但含量均較低，并不適合作為控制白及質(zhì)量的指標(biāo)。白及多糖作為白及的主要活性成分，含量高達(dá)20%，具有促進(jìn)造血、止血、治療口腔潰瘍與胃潰瘍、增加免疫因子的表達(dá)、愈合燙傷創(chuàng)面、抗菌和抗腫瘤等作用。本品為白及與酸漿果實(shí)的水提物，含有一定量的多糖，通過白及藥材化學(xué)成分的研究從中制備出白及多糖，并以其為指標(biāo)成分控制白及及制品的質(zhì)量。

2.4.1 供試品溶液的制備

精密稱取本樣品2g置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液5mL，加無水乙醇30mL，搖勻，靜置1h，離心5min（4000r/min），棄去上清液，沉淀熱水溶解后用量筒定容至50mL，搖勻，即得。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的18.09mg D-無水葡萄糖對(duì)照品置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含0.1809mg無水葡萄糖的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4.3 蒽酮硫酸試液的配制

精密稱取蒽酮0.2g置于100mL容量瓶，加硫酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 測(cè)定波長的選擇

分別精密量取1mL供試品和D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液置于不同刻度管中（10mL），分別加入1.0mL水，搖勻，再分別加入0.2%蒽酮硫酸溶液各6mL，混勻，沸水浴放置10min后立即冰浴冷卻10min，取出后以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，測(cè)量光譜圖，對(duì)照品和供試品在波長590nm處均有最大吸收，見圖3。

圖3 葡萄糖對(duì)照品和供試品光譜圖

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL刻度管中，加水至2.0mL，搖勻，加入0.2%蒽酮硫酸溶液6mL，混勻，沸水浴中加熱10min后立即冰浴冷卻10min，取出后以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在625nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù)（mg）X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4），并計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)?；貧w方程為A=4.4002X +0.0014（r=0.9996），線性范圍為0.0362～0.181mg。

圖4 工作曲線圖

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品1.0、2.0、3.0g各3份，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取供試液2mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法——精密加入0.2%蒽酮硫酸溶液6mL，依法測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，供試品在1～3g的稱量范圍內(nèi)，方法重復(fù)性良好。

2.4.7 對(duì)照品溶液和供試品溶液顯色后穩(wěn)定性考察

分別取葡萄糖對(duì)照品1mL和供試品2mL，加水至2.0mL，用0.2%蒽酮硫酸溶液顯色，以相應(yīng)的試劑作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度，每隔10min讀數(shù)，共考察50min。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液和供試品溶液的吸光度平均值分別為0.507、0.332，RSD分別為0.43%、0.16%，表明本法測(cè)定樣品顯色后在50min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 準(zhǔn)確度

2.4.8.1 精制白及多糖的提取和精制

稱取50g白及藥材粗粉，回流提取2h（80%乙醇），共提取2次，棄去提取液；繼續(xù)用熱水提取殘?jiān)?次，濃縮提取液，加入一定量乙醇，使醇含量達(dá)到80%，靜置醇沉，沉淀物加水溶解后用Savage法除蛋白5次，再醇沉第二次；分別用無水乙醇和丙酮洗滌沉淀物，揮去有機(jī)溶劑，即得精制白及多糖。

2.4.8.2 換算因子的測(cè)定

精密稱取21.60mg白及多糖置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，再精密量取5mL該溶液置于10mL量瓶中，加水至刻度，定容，搖勻，即得多糖供試品溶液。然后，精密量取1mL供試品溶液測(cè)定吸光度。以多糖質(zhì)量數(shù)與無水葡萄糖質(zhì)量數(shù)的比值為換算因子f，即f=W/C。通過測(cè)量計(jì)算，換算因子平均值為f=1.718，RSD值為1.39%，見表2。

表2 換算因子測(cè)定結(jié)果

2.4.9 回收率

稱取精制白及多糖304.93mg置于50mL量瓶中，加適量熱水溶解，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，得到每1mL含白及多糖6.0986mg的溶液。精密稱取1g已測(cè)定多糖含量的制劑（平均含量以無水葡萄糖計(jì)為1.82%，換算為多糖再計(jì)算回收率）置于50mL量瓶中，共稱取9份，分別精密加入白及多糖溶液2.5、5、7.5mL，每個(gè)體積3份（所取樣品量中多糖質(zhì)量數(shù)的50%、100%和150%），供試品溶液的制備方法同上。結(jié)果顯示，本法平均回收率為100.4%，RSD為2.8%。

2.4.10 制劑中多糖含量的測(cè)定

按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案制備供試液和對(duì)照品溶液，用0.2%蒽酮硫酸溶液顯色，測(cè)定3批樣品中多糖的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(以無水葡萄糖計(jì)，%)

根據(jù)制備工藝研究和含量測(cè)定結(jié)果，暫定本品含多糖以無水葡萄糖計(jì)，不得少于1.5%。