中藥抗菌噴霧的體外抗菌性能檢測(cè)

張瑞 林明玥 王晨鑫 李雨帆 尹怡靜 趙興剛 鄒琴

摘要 [目的]研究含多種中藥成分的抗菌噴霧的體外抗菌效果并對(duì)其抗菌機(jī)理進(jìn)行分析。[方法]選用大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）2種菌，用肉湯稀釋法和熒光染色法測(cè)定抗菌噴霧對(duì)其抑菌活性、抑菌率、最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），用濾紙片法測(cè)定其抑菌環(huán)，用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察抗菌噴霧對(duì)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的影響。[結(jié)果] 中藥抗菌噴霧在極短的時(shí)間內(nèi)對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率就能達(dá)到100%，濾紙法顯示抑菌環(huán)明顯;MIC和MBC結(jié)果說明了中藥抗菌噴霧在稀釋5倍之后仍對(duì)2種細(xì)菌具有抑制作用;噴霧作用后的細(xì)菌大量死亡，表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化。[結(jié)論]多種中藥成分的抗菌噴霧對(duì)E.coli和S.aureus具有顯著的聯(lián)合抑菌效果。

關(guān)鍵詞 中藥抗菌噴霧;植物抗菌;抗菌活性;熒光染色;超微結(jié)構(gòu);抗菌機(jī)理

中圖分類號(hào) R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）10-0167-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antibacterial Performance Test of Traditional Chinese Medicine Antibacterial Spray in Vitro

ZHANG Rui，LIN Ming-yue，WANG Chen-xin et al

（Research Center for Nano-Biomaterials，Analytical & Testing Center， Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065）

Abstract [Objective] To study the in vitro antibacterial effect of an antibacterial spray which contains several kinds of traditional Chinese medicine and analyze its antibacterial mechanism.[Method]Escherichia coli （E.coli） and Staphylococcus aureus （S.aureus） were selected to determine the antibacterial activity， antibacterial rate， minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of antibacterial spray by broth microdilution method and fluorescence staining method. The inhibition zone was determined by filter paper method. The effects of antibacterial spray on the surface structure and ultrastructure of bacteria were observed by scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM）. [Result] The antibacterial rate of traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus could reach 100% in a very short time. Filter paper method demonstrated obvious inhibition zone. The results of MIC and MBC indicated that the traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus still had two kinds of bacteria inhibition effect after 5 times dilution. After spraying， a large number of bacteria died， and the surface and internal structure changed evidently. [Conclusion]The antibacterial spray of various kinds of Chinese medicine has remarkable bacteriostatic effect on E.coli and S.aureus.

Key words Traditional Chinese medicine antibacterial spray;Plant antibacterial;Antibacterial activity;Fluorescent staining;Ultrastructure;Antibacterial mechanism

抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用使多種由致病菌引起的細(xì)菌感染性疾病有了很好的控制和治療效果，大大地降低了人類細(xì)菌感染引起的發(fā)病率和死亡率。但抗菌藥物在發(fā)揮強(qiáng)大抗菌功效的同時(shí)，致病菌也不斷對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生適應(yīng)性，即耐藥性[1]。天然中草藥因具有毒性低、抗菌范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而成為研究的熱點(diǎn)。此次試驗(yàn)所使用的中藥抗菌噴霧，其主要成分為乙醇、苯扎氯銨和多種中草藥（薄荷浸提液、黃芩提取物、苦參提取物）。其中薄荷（Mentha hapiocalyx Briq.）為唇形科薄荷屬多年生宿根草本植物，在我國分布范圍廣，是一種藥食兼用作物，被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)[2]。薄荷主要提取物薄荷醇是一種應(yīng)用廣泛的清涼劑，其具有殺菌、防腐等活性及經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)[2]。黃芩（Scutellaria baienlensis Georgi.）為唇形科植物黃芩的根，多年生草本，其藥用歷史悠久[3]。黃芩活性成分主要為黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗過敏等作用，在醫(yī)藥和其他領(lǐng)域有著廣泛用途[4]?？鄥ⅲ⊿ophora flavescens Ait.）為豆科槐屬植物苦參的干燥根，其提取物具有抗菌、抗炎作用等[5]。

相較中藥單味藥而言，多重中藥的聯(lián)合抗菌使其具有多向性、多層面、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，使菌難以同時(shí)產(chǎn)生對(duì)抗多種抗菌成分的多重突變，能有效達(dá)到治療目的。中藥抗菌噴霧能有效殺滅多種致病菌，主要用于鞋、襪、衣物等表面的抗菌除臭，防止菌滋生。該研究通過肉湯稀釋法、熒光染色法測(cè)定抗菌噴霧抑菌活性、抑菌率、最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），用濾紙片法測(cè)定不同菌株的抑菌環(huán)并結(jié)合掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）的觀察分析抗菌噴霧對(duì)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的影響，研究其抗菌機(jī)理，以期為天然植物抗菌劑的充分開發(fā)利用提供新思路，也為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)植物種植品種的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

中藥抗菌噴霧（福方醫(yī)療器械有限公司研發(fā)），主要成分為乙醇、苯扎氯銨和薄荷浸提液、苦參提取物、黃芩提取物等。磷酸鹽緩沖液藥片（phosphate buffered saline，PBS）（賽默飛世爾科技有限公司）;胰蛋白胨、瓊脂（上海阿拉丁試劑有限公司）;50%戊二醛（上海阿拉丁試劑有限公司）;無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）;Live-Dead 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 儀器

掃描電子顯微鏡（型號(hào)HITACH S530，日本電子株式會(huì)社）;場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（型號(hào)G2 F20 S-TWIN，美國Tecnai公司）;熒光倒置顯微鏡（型號(hào)Eclipse TI-U，日本尼康（Nikon）公司）;無菌工作臺(tái)（型號(hào)VS-1300-U，蘇州凈化設(shè)備有限公司）;立式蒸汽滅菌鍋（型號(hào)LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）;臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)L420，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)SPX-160B-2，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;精密電子天平（型號(hào)BT-25S，德國Sartorius AG集團(tuán)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)。

試驗(yàn)菌株革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（S.aureus，CMCC26003）、革蘭氏陰性菌大腸桿菌（E.coli，ATCC25922）均采購于上海保藏生物技術(shù)中心。將6 g 蛋白胨置于錐形瓶中，加入200 mL 蒸餾水，超聲至完全溶解后，制得液體培養(yǎng)基，壓膠塞，高壓滅菌（表壓0.7 kg/cm2，121 ℃，30 min），取出放涼后備用。將3 g蛋白胨和3 g瓊脂置于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，超聲分散均勻，壓膠塞，高壓滅菌后倒入培養(yǎng)皿，放涼后制得固體培養(yǎng)基備用。取少量細(xì)菌凍干粉溶于液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，菌液轉(zhuǎn)種到固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫孵育18 h后經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)后備用[6]。

1.3.2 抑菌率的測(cè)試。

用無菌接種環(huán)取較大菌落于液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，加滅菌生理鹽水調(diào)整至3×105～4×105 CFU/mL，將菌懸液分裝于5支離心管（3 mL/管），分別向管內(nèi)噴灑抗菌噴霧，作用時(shí)間為0、1、2、3、4 s。作用后的液體培養(yǎng)基于恒溫37 ℃培養(yǎng)18 h，濃度梯度稀釋103和104倍后，將稀釋后的細(xì)菌液各取100 μL 接種至固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，拍照并作活菌菌落計(jì)數(shù)，按公式（1）計(jì)算抑菌率X[7]。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

X=Wb-WsWb×100% （1）

式中，Wb為對(duì)照液平均菌落數(shù)（CFU/mL）;Ws為試驗(yàn)液平均菌落數(shù)（CFU/mL）。

1.3.3 抑菌環(huán)的測(cè)定。

將3 g蛋白胨和3 g瓊脂置于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，超聲分散均勻，壓膠塞，高壓滅菌（壓力0.7 kg/cm2，溫度121 ℃，時(shí)間30 min）后倒入培養(yǎng)皿，冷卻到 50 ℃?zhèn)溆?，? mL濃度為 1×108～2×108 CFU/mL的菌液加入培養(yǎng)皿，用冷至40～45 ℃的培養(yǎng)基15 mL作傾注轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻備用。向無菌圓形濾紙片（φ7 mm）分別噴灑抗菌噴霧，作用時(shí)間為0、1、2、3、4 s制成藥敏紙片，貼于上述制備的含菌培養(yǎng)基表面，放于37 ℃恒溫孵育24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。重復(fù)試驗(yàn)5次，對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.4 最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定。

用接種環(huán)挑取形態(tài)相似金黃色葡萄球菌S.aureus（CMCC26003）和大腸桿菌E.coli（ATCC25922）菌落3～5個(gè)，分別接種于4～5 mL的液體培養(yǎng)基中，pH 7.2～7.4，35 ℃孵育2～6 h。增殖后的對(duì)數(shù)生長期菌液用液體培養(yǎng)基校正濃度（1×108～2×108 CFU/mL）。

取96孔板，于12個(gè)孔中加入100 μL液體培養(yǎng)基，在第1孔加入100 μL抗菌劑原液與液體培養(yǎng)基混勻，然后吸取100 μL至第2孔，混勻后再吸取100 μL至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔，并從第10孔中吸取100 μL棄去，第11孔為不含抗菌液的生長對(duì)照。然后在每孔內(nèi)加入100 μL 菌液混勻，使每孔最終菌液濃度為0.5×108～1×108 CFU/mL。置37 ℃孵箱中孵育24 h;以肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細(xì)菌生長者，即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）[8]。確定MIC后，用接種環(huán)分別沾取MIC 值左右 3～5 孔的樣本，接種于固體培養(yǎng)基上，置于 37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng) 18～24 h。用活菌計(jì)數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落，平均數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋濃度即為該菌的最低殺菌濃度（MBC）。試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.3.5 Live-Dead染色。

在96孔板中的9個(gè)孔分別加入5 μL培養(yǎng)菌懸液（3×105～4×105 CFU/mL），以3個(gè)孔為一組，每組噴灑抗菌噴霧的時(shí)間分別為0、1、2 s，將96孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，滴入3 μL Live-Dead細(xì)菌染液（避光條件下將等量的 SYTO9染色劑和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染色劑混合）混勻后避光室溫孵育15min，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.6 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。

將3塊無菌圓形玻片放在24孔板中，在玻片中心滴100 μL菌懸液（3×105～4×105 CFU/mL），分別向玻片噴灑抗菌噴霧，時(shí)間為0、1、2 s，之后加入100 μL液體培養(yǎng)基，使細(xì)菌自然沉降在玻片表面于37 ℃培養(yǎng)2 h，用無菌 PBS 緩沖液沖洗 3 次，去除玻片表面未黏附的細(xì)菌。樣本用2.5%戊二醛4 ℃ 固定2 h用梯度乙醇溶液脫水：30%、50%、75%、80%、90%各10 min，100%乙醇3次，每次10 min。乙酸異戊酯替換15 min，臨界點(diǎn)干燥，噴金后于掃描電鏡下觀察，拍照。

1.3.7 透射電子顯微鏡（TEM）觀察。

將3 mL菌液（1×108～2×108 CFU/mL）依次分裝在3支1.5 mL EP管中，分別向管中噴灑抗菌噴霧時(shí)間為0、1、2 s，無菌條件下共培養(yǎng)2 h，離心（1 000 r/min，5 min）后棄上清液，加入0.5%戊二醛固定液重懸后，在4 ℃環(huán)境固定10 min后，高速離心（12 000 r/min，10 min）棄上清液，再加入3%戊二醛固定液固定2 h，PBS漂洗3次，鋨酸固定，系列濃度丙酮加乙醇梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%，每個(gè)濃度脫水10 min），環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鈾鉛電子染色，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果

抗菌噴霧不同作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌（E.coli）抑菌效果與菌落數(shù)如圖1和表1所示，以不同噴灑時(shí)間向裝有E.coli 菌懸液（3×105～4×105 CFU/mL）的試管中噴灑抗菌噴霧，作用后的菌懸液樣本經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，稀釋接種至固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，未噴灑抗菌劑的樣本（圖1a1、a2）稀釋103倍后接種培養(yǎng)顯示E.coli 成片生成，無法計(jì)數(shù)，樣本稀釋104倍后接種培養(yǎng)顯示大量生長的E.coli計(jì)數(shù)為2 779 CFU;而噴灑時(shí)間為1、2、3、4 s的樣本稀釋103和104倍后接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后均未見E.coli生長。

抗菌噴霧不同作用時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）抑菌效果與菌落數(shù)如圖2和表2所示，以不同噴灑時(shí)間向裝有S.aureus菌懸液（3×105～4×105 CFU/mL）的試管中噴灑抗菌噴霧，作用后的菌懸液樣本經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，稀釋接種至固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，未噴灑抗菌劑的樣本（圖2a1、a2）稀釋103倍后接種培養(yǎng)也顯示成片S.aureus生成，無法計(jì)數(shù)，樣本稀釋104倍后接種培養(yǎng)顯示大量生長的S.aureus計(jì)數(shù)為2 347 CFU，而噴灑時(shí)間為1、2、3、4 s的樣本稀釋103和104倍后接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后均未見S.aureus生長。

2.2 抑菌環(huán)

從抗菌噴霧作用紙片不同時(shí)間后對(duì)E.coli抑菌環(huán)照片（圖3a）可以看出，沒有抗菌噴霧的樣片周圍沒有抑菌環(huán)，而噴灑1～4 s的樣片周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌環(huán)，噴灑1 s的樣品抑菌環(huán)直徑為（9.7±0.2）mm，隨著時(shí)間延長到2 s 抑菌環(huán)出現(xiàn)了明顯的增長（P<0.05），而當(dāng)時(shí)間進(jìn)一步增加，各樣本（2～4 s）抑菌環(huán)直徑?jīng)]有明顯差異（圖4a）。

從抗菌噴霧作用紙片不同時(shí)間后對(duì)S.aureus抑菌環(huán)照片（圖3b）可以看出，沒有抗菌噴霧的樣片周圍S.aureus沒有出現(xiàn)抑菌環(huán)，噴灑后的樣本均具有明顯抑菌環(huán);噴灑 1 s 的樣品抑菌環(huán)的直徑為（21.6±0.2）mm，當(dāng)時(shí)間進(jìn)一步增加后，作用3、4 s的抑菌環(huán)直徑較1、2 s雖有所減小，但抗菌噴霧仍對(duì)S.aureus具有明顯的抑菌作用（P<0.01）（圖4b）。

S.aureus組的抑菌環(huán)較E.coli組寬，表明對(duì)S.aureus的抑菌效果優(yōu)于E.coli。

2.3 MIC和MBC

表3是大腸桿菌和金黃色葡萄球菌被稀釋不同倍數(shù)的抗菌劑作用后的細(xì)菌生長情況。從MIC試驗(yàn)可以看出，抗菌噴霧稀釋5倍后仍對(duì)2種細(xì)菌的生長具有顯著的抑制作用，隨著稀釋倍數(shù)的增加，固體培養(yǎng)基表面菌落數(shù)增加，試劑的殺菌作用逐漸降低，因此，抗菌劑的大腸桿菌MIC和金黃色葡萄球菌MIC均為6倍稀釋液;MBC試驗(yàn)表明，經(jīng)過涂板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在試劑稀釋5倍之后有少量的菌落生成，隨著稀釋倍數(shù)的增加，菌落數(shù)逐漸增多，得出抗菌劑的大腸桿菌MBC為5倍稀釋液。金黃色葡萄球菌在試劑稀釋6倍之后開始逐漸出現(xiàn)菌落，隨后菌落數(shù)逐漸增多，抗菌劑的金黃色葡萄球菌MBC為6倍稀釋液。

2.4 活死細(xì)菌熒光染色

活死細(xì)菌染液的成分為SYTO9綠色熒光核酸染色劑和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染色劑，它們光譜特征和穿透健康細(xì)菌細(xì)胞的能力都不同，可對(duì)活死細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行染色。單獨(dú)使用時(shí)，SYTO9染色劑通常會(huì)標(biāo)記一個(gè)群體中的所有細(xì)菌（包括膜完整的細(xì)菌和膜受損的細(xì)菌），碘化丙啶僅穿透膜受損的細(xì)菌，當(dāng)2種染料同時(shí)存在時(shí)，會(huì)導(dǎo)致SYTO9染色熒光減弱。當(dāng)SYTO9和碘化丙啶染色劑混合使用時(shí)，細(xì)胞膜完整的細(xì)菌呈熒光綠色，而細(xì)胞膜受損的細(xì)菌呈熒光紅色。這些染料的最大激發(fā)/發(fā)射波長分別為SYTO9染料的480/500 nm和碘化丙啶染料的490/635 nm，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。

在倒置熒光顯微鏡下同時(shí)觀察，正常生長的大腸桿菌（圖5a1）和金黃色葡萄球菌（圖5b1）經(jīng)Live/Dead熒光染色后可觀察到大量綠色熒光，沒有觀察到明顯的死亡細(xì)菌（紅色熒光）;當(dāng)對(duì)大腸桿菌施加1 s抗菌試劑后，可以觀察到大量的死細(xì)菌，未見明顯的活細(xì)菌（圖5b2），隨著作用時(shí)間增長到2 s后，細(xì)菌幾乎全部被殺死（圖5C2），無綠色熒光。在金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組中，未噴抗菌試劑的樣本（圖5d1）可觀察到大量被染成綠色的活菌，施加抗菌噴霧1 s后活菌數(shù)量減少，出現(xiàn)了大量被染成紅色熒光的死菌（圖5e2），抗菌噴霧作用時(shí)間到2 s后幾乎只有紅色熒光（圖5f2）。

2.5 細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)變化

掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察噴霧作用前后細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)變化如圖6所示，大腸桿菌是革蘭氏陰性短桿菌，正常生長狀態(tài)下大小0.5×10-3μm 細(xì)菌表面致密，有皺縮，無芽孢（圖6a1），抗菌試劑作用1 s后（圖6a2），大腸桿菌細(xì)胞壁出現(xiàn)溶解坍塌狀態(tài)，菌體呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，有出泡現(xiàn)象，隨著作用時(shí)間增加到2 s（圖6a3）大腸桿菌菌體皺縮、凝聚，表面結(jié)構(gòu)完全破壞?？咕鷩婌F作用前金黃色葡萄球菌為球形，直徑0.8 μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀，細(xì)胞壁光滑無芽孢（圖6b1）;噴霧作用1 s后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁表面粗糙并有明顯凸起（圖6b2），作用2 s后菌體表面出現(xiàn)大量不規(guī)則芽孢（圖6b3）。

2.6 細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)變化

透射電子顯微鏡（TEM）下的細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)如圖7所示。大腸桿菌具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，周生鞭毛，胞內(nèi)只含有核糖體等簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，有擬核沒有細(xì)胞核（圖7a1）;抗菌試劑作用1 s后的大腸桿菌菌體發(fā)生變形，細(xì)胞質(zhì)固縮，并且細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁開始出現(xiàn)質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁變薄甚至缺損（圖7a2）;當(dāng)抗菌試劑作用2 s后，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)固縮，染色較深，細(xì)胞壁變形，細(xì)胞膜嚴(yán)重破壞，大部分細(xì)胞質(zhì)外漏而形成空腔（圖7a3）。

金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜光滑、完整，內(nèi)部的細(xì)胞質(zhì)均勻，大量細(xì)菌處于分裂狀態(tài)，在細(xì)菌的正常繁殖期，可見到明顯的細(xì)胞中隔（圖7b1）;抗菌試劑作用1 s后，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁部分缺損，有內(nèi)容物外泄，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不清晰（圖7b2）;當(dāng)抗菌試劑作用2 s后，大量細(xì)菌出現(xiàn)質(zhì)壁分離，部分細(xì)菌出現(xiàn)空腔，同時(shí)可以看出部分分裂狀態(tài)的金黃色葡萄球菌中隔細(xì)胞壁變異，失去明顯的輪廓（圖7b3）。

3 結(jié)論與討論

該研究的中藥抗菌噴霧試劑中苯扎氯銨含量占比在10%左右，乙醇含量占比不低于70%，其余為具有抗菌作用的中草藥成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，該種抗菌噴霧在極短的作用時(shí)間內(nèi)就對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，MIC和MBC結(jié)果顯示該抗菌噴霧在較低的濃度下仍具有快速殺滅革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌的作用，通過計(jì)算可以得到其對(duì)2種細(xì)菌的抑菌率為100%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的抗菌率（≥70%），因此抗菌試劑具有良好的抗菌功能性[9]。

抗菌噴霧要得到快干效果，其主要成分為75%乙醇，醇類能快速將微生物浸濕穿透，乙醇分子進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的肽鏈，使蛋白質(zhì)變性沉淀，在極短的時(shí)間內(nèi)快速殺死細(xì)菌。但從抗菌噴霧對(duì)金黃色葡萄球菌的3、4 s作用時(shí)間抑菌環(huán)數(shù)據(jù)可以看出，由于乙醇的揮發(fā)速度較快，無法達(dá)到長時(shí)間的抗菌效果，所以隨著時(shí)間的增長，其殺菌作用受到限制。為了解決醇類殺菌作用持續(xù)時(shí)間短的問題，在抗菌噴霧中加入苯扎氯銨是利用季銨鹽類消毒劑主要優(yōu)點(diǎn)（能較長時(shí)間抑制細(xì)菌的生長繁殖）[10]與醇類進(jìn)行配比，配合殺菌。其中苯扎氯銨系廣譜殺菌劑，其殺菌機(jī)理是基于烷基銨陽離子在細(xì)菌細(xì)胞表面的吸附，擴(kuò)散穿過細(xì)胞壁，然后結(jié)合并破壞細(xì)胞質(zhì)膜。從TEM的結(jié)果可以看出抗菌噴霧作用后的細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生了破壞，內(nèi)部物質(zhì)滲出，對(duì)膜的破壞導(dǎo)致鉀離子和其他細(xì)胞質(zhì)成分的釋放最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[11]，這一現(xiàn)象有效驗(yàn)證了這一殺菌機(jī)理。同時(shí)大腸桿菌施加抗菌噴霧之后，在TEM下觀察可以看出細(xì)菌發(fā)生質(zhì)壁分離，內(nèi)部出現(xiàn)了大量的空腔結(jié)構(gòu)，推測(cè)是苯扎氯銨能夠在水中攜帶正電荷的物質(zhì)，與攜帶負(fù)電荷的細(xì)菌等微生物結(jié)合，經(jīng)滲透作用直至類脂層，使得細(xì)胞膜滲透性發(fā)生變化[12];當(dāng)噴霧作用時(shí)間延長，苯扎氯銨達(dá)到一定濃度，細(xì)菌便會(huì)形成胞膜非雙層結(jié)構(gòu)，在SEM試驗(yàn)結(jié)果中可見金黃色葡萄球菌的胞膜發(fā)生了變異，形成了大量的凸起，其膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞。最后苯扎氯銨為陽離子表面活性劑，加入抗菌噴霧后賦予噴霧清潔、去污、去角質(zhì)及保濕作用[13]。

噴霧中的植物提取成分薄荷醇具有廣譜抗細(xì)菌群體感應(yīng)活性，強(qiáng)烈干擾?；呓z氨酸內(nèi)酯調(diào)節(jié)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的致病因子和生物膜形成，同時(shí)能顯著抑制金黃色葡萄球菌中α-溶血素、腸毒素A和B以及毒素休克綜合征毒素1的表達(dá)，而不會(huì)干擾金黃色葡萄球菌的生長[14]，從而推測(cè)出抗菌噴霧作用2 s后，金黃色葡萄球菌的Live/Dead染色顯示雖然還有少量活細(xì)菌生長，但這些活細(xì)菌毒素基因表達(dá)已受到了限制。中藥抗菌噴霧中的另一植物提取成分黃芩素只引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透性的改變，并未破壞細(xì)胞膜的完整性，其抑菌作用靶點(diǎn)在胞內(nèi)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其能影響金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性、干擾菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、抑制三羧酸循環(huán)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的活性，最終達(dá)到抑菌效果[15]，從金黃色葡萄球菌的掃描電鏡可以看出細(xì)菌由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)了大量不規(guī)則的芽孢，從而猜測(cè)是黃芩素的作用效果。同時(shí)黃芩素抗大腸桿菌機(jī)制可能與阻斷ATP合成酶有關(guān)[16]，這一機(jī)理導(dǎo)致了抗菌噴霧作用后的透射電鏡觀察下的大腸桿菌分裂過程不完整?？咕鷩婌F中苦參堿能夠抑制大腸桿菌體內(nèi)DNA合成前期與細(xì)胞分裂相關(guān)的某些蛋白的合成[17]，使得細(xì)菌難以越過I期，進(jìn)入DNA合成的R期，破壞了細(xì)菌正常的生長周期，從而抑制了細(xì)胞分裂，從大腸桿菌在抗菌噴霧作用后的透射電鏡圖中進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，同時(shí)苦參堿還會(huì)與菌體內(nèi)的蛋白結(jié)合，引起固縮、解體使其死亡，掃描電鏡下也觀察到了大腸桿菌施加噴霧之后菌體整體出現(xiàn)了溶解坍塌。在抑菌環(huán)試驗(yàn)中噴霧對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)明顯大于大腸桿菌，推測(cè)是苦參提取物乙酸乙酯具有良好的自由基清除能力，對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌作用[18]。

添加了多種中草藥成分的復(fù)方抗菌劑抗菌機(jī)理較復(fù)雜，觀察抗菌噴霧作用后的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步證明其對(duì)2種菌的作用機(jī)理?？咕噭┲械亩喾N中藥提取物能夠溶于乙醇中，通過乙醇的滲透擴(kuò)散作用，中藥提取物能夠穿過表面進(jìn)入細(xì)胞膜，完成半滲透作用，再進(jìn)一步穿入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)酶鈍化、蛋白質(zhì)變性并凝集，胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏，從而破壞了微生物的正常代謝，借此來殺死細(xì)菌[19]。該中藥抗菌中這幾類中草藥都是近年發(fā)展應(yīng)用較多的天然植物成分，其廣譜抗菌抗炎的生物活性已經(jīng)被諸多科學(xué)研究所證實(shí)[20]，但這只是天然藥物研發(fā)的前期工作，起到初步定性篩選作用，在后續(xù)研究中還需對(duì)篩選出的植物資源進(jìn)一步分離、純化，鑒定其結(jié)構(gòu)，分析抗菌機(jī)理，用以篩選和開發(fā)新穎、安全和環(huán)境友好的植物天然殺菌劑，從而為天然植物活性成分在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[21]。

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