基于16s rRNA的徽派臘肉加工過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

周瑩 王兆明 涂健 陳興勇 徐寶才

摘要：為探究徽派臘肉加工過程中的微生物群落演替規(guī)律，采用高通量測序技術(shù)對不同加工階段的徽派臘肉中微生物16S rRNA進(jìn)行V₃～V₄區(qū)測序，比較不同加工階段（鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期、成熟結(jié)束）臘肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性差異。結(jié)果表明：5 個(gè)加工階段分別獲得80 155、80 116、80 174、80 114、80 174 條有效序列;在門分類水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinomycetes）、擬桿菌門（Bacteroides）相對豐度較高;在屬分類水平上，鮮肉、腌制中期和腌制結(jié)束的臘肉中主要優(yōu)勢菌為乳球菌（Lactococcus）和假單胞菌（Pseudomonas），成熟中期和成熟結(jié)束的臘肉中主要優(yōu)勢菌為葡萄球菌（Staphylococcus）、鹽弧菌（Salinivibrio）和放線菌（Actinomycetes）。微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性在徽派臘肉不同加工階段存在明顯差異。

關(guān)鍵詞：徽派臘肉;高通量測序;發(fā)酵;微生物群落;細(xì)菌多樣性

Analysis of Microbial Community Structure during the Processing of Hui-Style Bacon by 16S rRNA Sequencing

ZHOU Ying^1，2，3， WANG Zhaoming^2，3， TU Jian¹， CHEN Xingyong¹， XU Baocai^{2，3，}*

（1.School of Tea and Food Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei ??230036， China; 2.School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei ??230009， China; 3.Engineering Research Center of Bio-process， Ministry of Education， Hefei University of Technology， Hefei ??230009， China）

Abstract：High throughput sequencing （HTS） was used to investigate the microbial community succession of Hui-style bacon samples at different processing stages （fresh meat， mid-curing， the end of curing， mid-maturation and the end of maturation）. The V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene was sequenced to compare the composition and diversity of bacterial community among the processing stages. The results showed that 80155， 80116， 80174， 80114 and 80174 effective sequences were obtained for the five processing stages， respectively. At ?the phylum level， Firmicutes， Proteobacteria， actinomycetes and Bacteroides were dominant. At the genus level，LactococcusandPseudomonaswere the dominant bacteria in fresh meat， at the mid-cuing stage and at the end of curing， whileStaphylococcus，Salinivibrioandactinomyceteswere the dominant bacteria at the mid-maturation stage and at the end of maturation. These findings showed that different processing stages had significant effects on the microbial community structure and diversity in Hui-style bacon.

Keywords：Hui-style bacon; high throughput sequencing; fermentation; microbial community; bacterial diversity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201215-289

中圖分類號：TS251.5?????????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???????????? 文章編號：

引文格式：

周瑩， 王兆明， 涂健， 等. 基于16s rRNA的徽派臘肉加工過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 肉類研究， 2021， 35（2）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201215-289.??? http：//www.rlyj.net.cn

ZHOU Ying， WANG Zhaoming， TU Jian， et al. Analysis of microbial community structure during the processing of hui-style bacon by 16S rRNA sequencing[J]. Meat Research， 2021， 35（2）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201215-289.??? http：//www.rlyj.net.cn

腌臘肉制品在我國有上千年的制作歷史^[1-2]，深受人民群眾的喜愛。生肉經(jīng)過腌制和成熟后，肉色臘紅、耐貯藏、色味鮮美、食用方便，有著獨(dú)特的腌臘風(fēng)味^[3-4]?；张膳D肉俗名“刀板香”，選料精良，制作復(fù)雜，原料采用徽州地區(qū)土雜豬厚度均勻的五花肉，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下（溫度、濕度），經(jīng)預(yù)處理、腌制、晾曬（輕發(fā)酵）等核心工藝加工而成，是具有典型特征品質(zhì)的腌臘肉制品?；张膳D肉成品具有高鹽含量和低水分含量的特點(diǎn)，兼具干腌肉制品和發(fā)酵肉制品特性。作為徽菜的典型代表，徽派臘肉是徽州文化的一張重要名片，是具有濃郁地方特色的中式傳統(tǒng)肉制品。

微生物的代謝產(chǎn)物與酶會對肌肉蛋白的降解、脂肪的氧化水解等有重要影響，在發(fā)酵過程中對臘肉風(fēng)味輪廓形成具有重要貢獻(xiàn)^[5]。有研究表明，腌臘肉制品的質(zhì)量與微生物的活動密切相關(guān)^[6-7]。Yu Hai等^[8]從如皋火腿中分離出1 株高效的轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)菌（肺炎克雷伯菌YZusK-4），并成功將其應(yīng)用到發(fā)酵肉制品中，達(dá)到顯著改善產(chǎn)品風(fēng)味的效果。Zhao Changqing等^[9]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌作為發(fā)酵劑，不僅可以改善肉品風(fēng)味，還可以有效抑制有害微生物生長，提高食用安全性。Berdague等^[10]通過在發(fā)酵香腸中接種發(fā)酵型乳酸菌和葡萄球菌等，發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生78 種風(fēng)味物質(zhì)，如烴、醛、酮等。類似地，Bruna等^[11]通過在發(fā)酵香腸中接種霉菌，發(fā)現(xiàn)接種后香腸的保質(zhì)期顯著延長，同時(shí)香腸的風(fēng)味物質(zhì)種類也顯著增加。不難發(fā)現(xiàn)，微生物在發(fā)酵肉制品風(fēng)味形成中起重要作用。全面了解臘肉的微生物群落演替有助于解析其風(fēng)味形成機(jī)制，并且可以為天然發(fā)酵劑的制備提供一定的理論依據(jù)。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）是食品行業(yè)的一項(xiàng)新興技術(shù)，可以準(zhǔn)確識別不同食物基質(zhì)中的微生物群落，并且能夠快速、準(zhǔn)確地獲取豐富的生物學(xué)數(shù)據(jù)和大量微生物學(xué)信息，已成為研究微生物多樣性和群落特性的主要方法之一^[12-13]。HTS不僅可以提供有關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)的信息，還可以提供實(shí)用的基因組成和相關(guān)分布^[14]。HTS技術(shù)在許多發(fā)酵食品中得到了廣泛應(yīng)用，如豆豉^[15]、泡菜^[16]、酸菜^[17]和發(fā)酵香腸^[18]等。目前，HTS技術(shù)也已經(jīng)被用來研究臘肉中的微生物群落結(jié)構(gòu)^[19-20]，但對徽派臘肉微生物結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道還很少。本研究基于HTS技術(shù)揭示徽派臘肉發(fā)酵過程中微生物的變化，旨在為探明徽派臘肉的品質(zhì)形成機(jī)制和商業(yè)化開發(fā)提供一定的參考。

1?? 材料與方法

1.1 ??徽派臘肉樣品采集

跟蹤采集徽派臘肉（2019年5月—2019年7月）1 個(gè)批次（約1 t）生產(chǎn)的完整過程。根據(jù)生產(chǎn)周期確定5 個(gè)采樣點(diǎn)（見表1）。取樣完成后，當(dāng)天將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室分離，每個(gè)樣品不少于1 000 g，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3 個(gè)平行樣品，混勻。準(zhǔn)確稱取10 g樣品，分裝至無菌真空袋中，按不同取樣周期編號。以上過程均在超凈微生物檢測臺上完成。

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 ??天根生化科技（北京）有限公司;515F/806R引物 ??武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司;DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒 ??德國Qiagen公司;5×Trans Start?Fast Pfu緩沖液 ??生工生物工程（上海）股份有限公司;Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer?? 美國New England Biolabs公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2?? 儀器與設(shè)備

DYY-6c電泳儀 ??北京六一儀器廠;WD-943B凝膠成像系統(tǒng) ??北京六一生物科技有限公司;ABI Step One Plus實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng) ??美國Life Technologies公司;Illumina Mi Seq PE300高通量測序平臺 ??美國Illumina公司;ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) ??美國Nano Drop公司。

1.3?? 細(xì)菌測序

對細(xì)菌序列16S rDNA V₃～V₄區(qū)域進(jìn)行相關(guān)測序。細(xì)菌16S rDNA V₃～V₄區(qū)應(yīng)用的引物為515F（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT-3′）。將稀釋后的DNA基因組作為模板，使用帶Barcode的特異引物、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增的效率和準(zhǔn)確性。擴(kuò)增條件：94 ℃、2 min，然后98 ℃、10 s，62 ℃、30 s，68 ℃、30 s進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后68 ℃、5 min。PCR產(chǎn)物用2%電泳凝膠進(jìn)行檢測。擴(kuò)增體系（50 μL）：5 μL 10×KOD緩沖液、5 μL 2 mmol/L dNTPs、3 μL 25 mmol/L MgSO₄、上下游引物各1.5 μL（10 μmol/L）、1 μL DNA聚合酶、100 ng模板DNA。然后使用1×TAE 2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，切出目標(biāo)條帶并對其進(jìn)行回收。文庫建成并測試合格后，上機(jī)測序。

1.4?? 數(shù)據(jù)分析及圖像處理

1.4.1? ?細(xì)菌群落α多樣性分析

α多樣性是反映物種豐富度和同質(zhì)性的綜合指標(biāo)，可用于分析樣本的復(fù)雜性，即樣本中群落的多樣性。利用Spss軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。其中包括Observed-otus、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋率。

1.4.2? ?細(xì)菌群落組成分析

采用RDP分類算法選擇其中最常見的序列作為代表操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）的序列。OTUs序列的物種注釋，用Mothur與SILVA132^[21]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫^[22]進(jìn)行設(shè)定閾值為0.8～1.0的物種注釋剖析，在每個(gè)分類層次計(jì)算每個(gè)樣本的界、門、綱、目、科、屬、種水平群落組成。使用MUSCLE（版本3.8.31）軟件^[23]對多個(gè)序列進(jìn)行快速測序，可以得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后，每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)都是平均值，以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，樣本中的最小數(shù)據(jù)量為標(biāo)準(zhǔn)。隨后的α多樣性分析和β多樣性分析基于均值數(shù)據(jù)。按照分析結(jié)果，繪制樣品的稀釋曲線、熱圖、菌群分布直方圖和高質(zhì)量序列分布圖。

2?? 結(jié)果與分析

2.1 ??不同加工階段臘肉中細(xì)菌測序結(jié)果分析

對徽派臘肉中提取的微生物總DNA進(jìn)行V₃～V₄區(qū)間的高通量測序，在優(yōu)化軟件數(shù)據(jù)后，對排序結(jié)果進(jìn)行排序和過濾。共獲得1 202 200 個(gè)高質(zhì)量序列，由表2可知，有效序列平均長度為253 bp。序列長度與所設(shè)計(jì)出的引物序列長度比較接近，說明臘肉樣本的測序結(jié)果比較合理，可以滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 ??不同加工階段臘肉中細(xì)菌多樣性分析

2.2.1? ?不同加工階段臘肉中細(xì)菌群落α多樣性分析

α多樣性主要指一定區(qū)域或特定生態(tài)系統(tǒng)本身的多樣性，是一種能夠反映物種豐富度和同質(zhì)性的綜合性質(zhì)指標(biāo)。α多樣性一方面與菌群豐富度有關(guān)，另一方面與菌群多樣性有關(guān)。菌群豐富度指數(shù)主要包括ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)。菌群多樣性指數(shù)主要包括覆蓋率和Shannon指數(shù)。Chao1指數(shù)可以估計(jì)微生物群落中的OTU數(shù)量，并計(jì)算微生物群落的豐度。通常而言，Chao1指數(shù)越大，樣品中的微生物群落物種總數(shù)越多。

由表3可知，在加工前期（鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期），Chao1指數(shù)較大，而成熟結(jié)束，Chao1指數(shù)明顯減小。ACE指數(shù)表現(xiàn)出與Chao1指數(shù)類似的變化規(guī)律，說明加工后期臘肉樣品中細(xì)菌群落豐富度變化較大。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以表征微生物的豐度和同質(zhì)性。Shannon指數(shù)越高，微生物群落的多樣性就越大。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，說明臘肉樣品中細(xì)菌群落多樣性隨發(fā)酵時(shí)間的延長發(fā)生了顯著變化，在加工后期，微生物多樣性降低。覆蓋率可以反映測序深度，覆蓋率越接近1，測序越合理。本研究中所有樣品覆蓋率均大于0.997，說明徽派臘肉樣品中的序列基本檢測到，測序結(jié)果可以反映徽派臘肉樣品中微生物的真實(shí)狀況。

2.2.2? ?不同加工階段臘肉中細(xì)菌稀釋曲線

稀釋和等級聚類曲線是用來描述樣品中微生物群落多樣性的曲線。稀釋曲線可以直接反映測序量的合理性，也可以間接反映樣品中物種的數(shù)量。由圖1可知，所有徽派臘肉樣品的稀釋曲線趨向平坦，表明測序深度合理。隨著測序深度的增加，加工過程中的各個(gè)階段臘肉樣本的稀釋曲線呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢。表示樣品選定的序列數(shù)據(jù)足夠多，可以反映樣品中大多數(shù)微生物區(qū)域的數(shù)據(jù)，測序結(jié)果合理。

等級聚類曲線是樣本中按相對豐度（或可用序列數(shù)）從大到小排序得到的對應(yīng)排序編號。在等級聚類曲線中，橫坐標(biāo)方向上，曲線的寬度反映了物種的豐富性。縱坐標(biāo)方向上，樣品中物種均勻度由曲線的平滑程度來表示。如果曲線顯示平滑，說明物種是均勻分布的^[24]。由圖2可知，隨著臘肉加工各個(gè)階段的加工時(shí)間增加，曲線呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢，說明在測序過程中物種分布較為均勻。

2.2.3? ?不同加工階段臘肉中細(xì)菌群落β多樣性分析

由圖3可知，徽派臘肉整個(gè)加工過程中，微生物的種間差異逐漸增加，在成熟后期，各物種間的差異達(dá)到最大。

2.3 ??不同加工階段臘肉中物種分布情況

2.3.1 ??物種相對豐度

在門分類水平上，共有47 個(gè)細(xì)菌門被檢出，選取豐度排名前10的細(xì)菌繪制相對豐度柱形圖。由圖4可知，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinomycetes）、擬桿菌門（Bacteroides）占主導(dǎo)地位。在整個(gè)加工過程中，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）具有主要優(yōu)勢。其中厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度最大，鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期和成熟結(jié)束的相對豐度分別為51.1%、38.2%、39.4%、38.8%和52.5%。其次，變形菌門（Proteobacteria）是另一優(yōu)勢微生物，鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期和成熟結(jié)束的相對豐度分別為33.7%、45.3%、39.0%、52.2%和42.8%。此外，放線菌門（Actinomycetes）在鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期和成熟結(jié)束的相對豐度分別為3.5%、3.9%、4.3%、1.3%和1.6%，而擬桿菌門（Bacteroides）在鮮肉、腌制中期、腌制結(jié)束、成熟中期和成熟結(jié)束的相對豐度分別為7.8%、9.3%、14.2%、5.7%和2.3%。

在屬分類水平上，樣品中共檢測到676 種細(xì)菌，選取豐度排名前30的細(xì)菌繪制相對豐度柱形圖。由圖5可知，在整個(gè)加工過程中，葡萄球菌（Staphylococcus）、乳球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）、鹽弧菌（Salinivibrio）和不動桿菌（Acinetobacter）的相對豐度較大，是優(yōu)勢細(xì)菌。李彥虎^[25]研究發(fā)現(xiàn)，隴西臘肉中主要細(xì)菌是環(huán)絲菌（Cyclomycetes）、肉桿菌（Botulinum）、乳球菌、假單胞菌（Pseudomonas）和嗜冷桿菌。董蘊(yùn)等^[26]研究發(fā)現(xiàn)，湖北恩施臘肉的主要細(xì)菌種類為葡萄球菌、嗜冷桿菌、假單胞菌、環(huán)孢菌（Cyclospora）、鹽單胞菌（Cobetia）和不動桿菌。Cordero等^[27]發(fā)現(xiàn)，使用食鹽的西班牙火腿中60%微生物為葡萄球菌。Rodríguez^[28]、Lorenzo^[29]等分別對意大利和西班牙火腿進(jìn)行研究，在發(fā)酵過程中與發(fā)酵后期，葡萄球菌和微球菌（Micrococcus）數(shù)量明顯上升，與本研究結(jié)果相似。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有抑制腐敗細(xì)菌生長的作用，并在發(fā)酵中起良好作用^[30]。由于徽派臘肉在發(fā)酵階段均處于低溫狀態(tài)，導(dǎo)致大量嗜低溫菌與耐鹽菌大量繁殖。而在臘肉的發(fā)酵過程中，樣品中的細(xì)菌明顯出現(xiàn)演替現(xiàn)象。例如，葡萄球菌相對豐度由鮮肉的0.3%到成熟結(jié)束時(shí)增加至44.2%，達(dá)到最高，可能是由于葡萄球菌對于環(huán)境因子的耐受性較高，葡萄球菌同時(shí)也是臘肉風(fēng)味的來源之一。不動桿菌相對豐度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在成熟中期時(shí)達(dá)到最高（16.6%），在成熟結(jié)束時(shí)降低至7.8%。鹽單胞菌屬（Halomonassp）（屬于圖中Others分類）在腌制過程中也呈現(xiàn)一直增加的趨勢，在成熟結(jié)束時(shí)達(dá)到最高（6.9%）。

2.3.2? ?物種豐度聚類熱圖

為更直觀表現(xiàn)徽派臘肉發(fā)酵過程中優(yōu)勢細(xì)菌的豐度變化，挑選相對豐度排名前35的屬繪制熱圖。

由圖6可知，鮮肉優(yōu)勢菌為乳酸菌（Lactobacillus）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、肉桿菌（Carnobacterium）和腸球菌（Enterococcus）等。腌制中期的主要細(xì)菌為腸桿菌（Enterobacteriaceae）。腌制結(jié)束的優(yōu)勢菌主要為雙歧桿菌（Bifidobacterium）、鏈球菌（Streptococcus）和嗜冷桿菌。成熟中期樣品的優(yōu)勢菌主要為嗜冷細(xì)菌（Psychrophilic bacteria）、弧菌（Vibrio），成熟結(jié)束，弧菌（Vibrio）、耐鹽菌和葡萄球菌（Staphylococcus）最為顯著。

在腌制階段，由于環(huán)境溫度較低，滲透壓較高，使得這個(gè)階段的優(yōu)勢菌以耐鹽菌與嗜冷菌為主。到了成熟階段，主要的變化以水分含量為主，并且不同類型的微生物相互抑制，使臘肉樣品中的菌群得到進(jìn)一步優(yōu)化。陳競適等^[31]在湘西臘肉中發(fā)現(xiàn)了微球菌、乳桿菌及葡萄球菌。Wang Xinghong^[32]、Wang Xinhui^[33]等在宣威火腿中發(fā)現(xiàn)了微球菌、棒狀桿菌和乳酸桿菌，在四川臘肉中發(fā)現(xiàn)了葡萄球菌、乳球菌和芽孢桿菌。Papamanoli等^[34]對廣式臘腸進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要微生物為乳桿菌、片球菌和葡萄球菌，與本研究較為一致。

2.3.3? ?LEfSe分析

LEfSe分析（線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）對數(shù)評分閾值≥4）展現(xiàn)的是有顯著性差異的物種，本研究用于分析明確不同階段處理過程中群落組成的異同。由圖7可知，鮮肉、成熟中期和成熟結(jié)束時(shí)，樣品中共有24 個(gè)明顯不同的類群。其中，成熟結(jié)束時(shí)的細(xì)菌群落明顯比鮮肉和腌制結(jié)束時(shí)多，并以弧菌、葡萄球菌和耐鹽菌為主。

由圖8可知，在鮮肉、成熟中期和成熟結(jié)束時(shí)，分別觀察到共有9、3、12 個(gè)分類群存在顯著差異，表明隨著生產(chǎn)過程的進(jìn)行，不同加工時(shí)間的群落組成相似度先減小后增加，說明在加工后期臘肉中逐漸形成優(yōu)勢菌。

3?? 結(jié)論

本研究采用HTS技術(shù)，對徽派臘肉中的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在臘肉發(fā)酵過程中，微生物群落發(fā)生較大變化，優(yōu)勢菌由乳球菌（Lactococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和芽孢桿菌（Bacillus）等逐漸演替為嗜冷桿菌（Psychrobacter）、弧菌（Vibrio）、鹽單胞菌（Halomonas）和葡萄球菌（Staphylococcus）;發(fā)酵時(shí)間越久，菌群分布越穩(wěn)定，優(yōu)勢菌越明顯。因此，對徽派臘肉進(jìn)行微生物測序研究有助于解析其獨(dú)特風(fēng)味的來源，同時(shí)為徽派臘肉生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的制定等提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2020-12-15

基金項(xiàng)目：中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JZ2020HGQA0150）;