肉品中食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

倪皓潔 周芷卉 傅玲琳 王翀 張德權(quán) 王彥波 李歡

摘? 要：肉品易受食源性致病菌污染，是食品安全監(jiān)管的重點(diǎn)。借由現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)快速可靠的鑒別及檢驗(yàn)肉品中的食源性致病菌具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文在總結(jié)肉品典型致病菌污染現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述了分子診斷法、免疫分析法、光譜檢測(cè)法及電子鼻檢測(cè)法等致病菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，在分析現(xiàn)有技術(shù)存在的主要問(wèn)題的同時(shí)，對(duì)其未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行了展望，旨在為肉品中食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的完善及提升提供參考與借鑒。

關(guān)鍵詞：肉品;食源性致病菌;分子診斷法;免疫分析法;光譜技術(shù);電子鼻

Advances in Detection Technologies for Foodborne Pathogenic Bacteria in Meat

NI Haojie1， ZHOU Zhihui1， FU Linglin1， WANG Chong1， ZHANG Dequan2， WANG Yanbo1， LI Huan1，*

（1. School of Food Science and Biotechnology， Zhejiang Gongshang University， Hangzhou 310018， China;

2.Institute of Food Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， National Risk Assessment Laboratory of Agro-products Processing Quality and Safety， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100193， China）

Abstract： Meat is subject to contamination by foodborne pathogenic bacteria， which has become one of the key points of food safety supervision and management. It is of great significance to identify and detect foodborne pathogenic bacteria in meat quickly and reliably by modern detection technology. Beginning with the current status of meat pollution by typical foodborne pathogenic bacteria， this paper reviews the currently available technologies for the detection of pathogenic bacteria such as molecular diagnosis， immunoassay， spectroscopy and electronic nose. The limitations and prospects of the detection technologies are also discussed. The review is expected to offer references for improving the limitations and developing new detection technologies.

Keywords： meat; foodborne pathogenic bacteria; molecular diagnosis; immunoassay; spectral analysis; electronic nose

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210309-059

中圖分類號(hào)：TS207.4? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號(hào)：

引文格式： 倪皓潔， 周芷卉， 傅玲琳， 等. 肉品中食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2021， 35（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210309-059.? ? http：//www.rlyj.net.cn? NI Haojie， ZHOU Zhihui， FU Linglin， et al. Advances in detection technologies for foodborne pathogenic bacteria in meat[J]. Meat Research， 2021， 35（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210309-057.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國(guó)是肉類生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年肉類總產(chǎn)量高達(dá)7758.8萬(wàn)t，居民人均肉類和禽類食品消費(fèi)量分別為26.9 kg和10.8 kg[1]。然而，肉品因營(yíng)養(yǎng)豐富，極易遭受食源性致病菌的污染，誘發(fā)各類食源性疾病。研究表明，食源性致病菌等微生物引起的食品安全問(wèn)題依然突出，引起的發(fā)病人數(shù)最多，2015年除西藏、臺(tái)灣外中國(guó)地區(qū)爆發(fā)的食源性疾病事件中，由微生物因素引起的發(fā)病人數(shù)高達(dá)51.5%[2]。因此，有效的預(yù)防和控制肉品中食源性致病菌的感染與傳播具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

肉品中常見(jiàn)的食源性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、致病性大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌及空腸彎曲桿菌等[3-4]。食用被食源性致病菌污染的肉品時(shí)，易引起惡心嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、胃腸炎等，更甚者引發(fā)死亡。我國(guó)對(duì)肉品中食源性致病菌的限量標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。建立高效、準(zhǔn)確、靈敏的肉品中致病菌檢驗(yàn)檢測(cè)方法，對(duì)于預(yù)防相關(guān)食源性疾病的發(fā)生和流行至關(guān)重要，也是肉類產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的迫切需要。鑒于此，本文在綜述肉品典型食源性致病菌污染現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，著重介紹了分子診斷、免疫分析、光譜檢測(cè)和電子鼻檢測(cè)等肉品中致病菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及應(yīng)用，分析其存在的主要問(wèn)題，并對(duì)未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行展望，以期為肉品中食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的完善及提升提供一定的參考與借鑒。

1肉品中常見(jiàn)致病微生物

1.1? ?沙門氏菌

沙門氏菌（Salmonella）屬革蘭氏陰性腸道桿菌，是一種人畜共患病原菌，為引起食物中毒最常見(jiàn)的致病菌之一[5]。沙門氏菌侵染腸道后會(huì)引起腸胃炎、敗血癥以及傷寒等疾病，被我國(guó)列為乙類傳染病[6]。在世界各國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒事件數(shù)量常列榜首，我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位[7-8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肉品中沙門氏菌的檢出率在美國(guó)為20%～25%、英國(guó)為9.9%，日本進(jìn)口家禽中沙門氏菌的污染率為10.3%，國(guó)內(nèi)肉品沙門氏菌的檢出率在1.1%～39.5%[9]。

1.2? ?金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）也稱“嗜肉菌”，為兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌，通常不具有致病性，但其產(chǎn)生的腸毒素會(huì)導(dǎo)致中毒，引起發(fā)燒、腹瀉和惡心嘔吐等癥狀[10]。近幾年，由金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒報(bào)道層出不窮，我國(guó)因其引起的食物中毒事件已居世界第4位[11]。

1.3? ?單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性疾病致病菌之一。人感染該菌所導(dǎo)致的住院率高達(dá)92%，死亡率達(dá)20%～30%，孕婦、兒童、老年人等為高危人群，感染后會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)，以及腦膜炎、發(fā)熱性胃腸炎等疾病[12-13]。據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分級(jí)研究，熟肉制品是我國(guó)單增李斯特菌病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率最高和最主要的食品之一[14]。

1.4? ?致病性大腸桿菌

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）屬革蘭氏陰性短桿菌，是一種條件致病菌。致病性大腸桿菌，按其致病作用可以分為腸道致病性大腸桿菌、腸道產(chǎn)毒素性大腸桿菌、腸道侵襲性大腸桿菌、腸道出血性大腸桿菌、腸集聚性大腸桿菌、腸產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌、尿道致病性大腸桿菌和黏附大腸桿菌[15]。世界范圍內(nèi)爆發(fā)嚴(yán)重的大腸桿菌感染事件中，幾乎都是由食物傳播引起的。屠宰環(huán)節(jié)是畜禽肉供應(yīng)鏈中致病性大腸桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)最高的環(huán)節(jié)[16]。

1.5? ?產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens）是一種芽孢桿菌科的革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，普遍存在并長(zhǎng)期存活于各類環(huán)境中，具有較高的傳播率，能導(dǎo)致氣性壞疽和食物中毒等病癥[17]。原料肉和熟肉制品均易被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染，其中，由牛肉制品污染引起的病例達(dá)40%[18]。

1.6? ?空腸彎曲桿菌

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）是一種微需氧的革蘭氏陰性菌，作為共生菌大量存在于動(dòng)物腸道內(nèi)，豬、牛、雞、狗是其最常見(jiàn)的傳染源和宿主[19-20]。在某些發(fā)達(dá)地區(qū)，空腸彎曲桿菌的感染率接近于沙門氏菌和志賀氏菌。感染空腸彎曲桿菌不會(huì)直接導(dǎo)致死亡，但其造成的一系列消化道及神經(jīng)疾病嚴(yán)重威脅人體健康[21]。

2食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法

目前，傳統(tǒng)生化培養(yǎng)分析法依舊是肉品中食源性致病菌檢驗(yàn)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該法通過(guò)樣品預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的定性和定量檢測(cè)[22]。傳統(tǒng)生化法在致病菌檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛、成本低、靈敏度高，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，檢驗(yàn)流程通常需要1～2 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、實(shí)時(shí)監(jiān)控等需求[23]。由于其基于致病菌可培養(yǎng)性的檢測(cè)原則，可能會(huì)導(dǎo)致樣品中致病菌種類及含量的檢測(cè)值低于實(shí)際值，檢測(cè)結(jié)果的假陰性率較高[24]。近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展改進(jìn)，相繼出現(xiàn)了許多以生化培養(yǎng)法為基礎(chǔ)、酶底物顯色法為原理的顯色培養(yǎng)基、測(cè)試片、全自動(dòng)微生物檢測(cè)鑒定儀等產(chǎn)品，但仍無(wú)法滿足自動(dòng)化、高通量的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)需求，從傳統(tǒng)人工操作向自動(dòng)化檢測(cè)的發(fā)展已經(jīng)成為肉品致病菌檢測(cè)技術(shù)不可逆轉(zhuǎn)的發(fā)展趨勢(shì)[13]。

3食源性致病菌檢測(cè)新技術(shù)

3.1? ?分子診斷法

基于核酸的分子診斷法是評(píng)估肉品食源性致病菌安全性的首選分析方法之一，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)周期短、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[25]，并逐漸向輕量便捷及多靶點(diǎn)同步檢測(cè)等方向發(fā)展。

3.1.1? ?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種以特定核酸序列為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸的重復(fù)循環(huán)過(guò)程進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)，簡(jiǎn)便易行、特異性強(qiáng)、靈敏度高[26]。Capobianco等[27]利用液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital PCR，ddPCR）檢測(cè)牛肉制品中產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌，成功區(qū)分了單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的志賀毒素基因和內(nèi)膜素基因。該方法無(wú)需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可直接對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)。Liu等[28]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR，qPCR）定量檢測(cè)了12種常見(jiàn)的食源性致病菌。該方法對(duì)肉類樣品中副溶血性弧菌的檢出限為103 CFU/g，對(duì)其他11個(gè)菌株的檢出限為104 CFU/g，且不同致病菌間無(wú)交叉反應(yīng)，具有快速、低成本、高通量、高特異性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)多種食源性致病菌的快速同步檢測(cè)，一系列多靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)相繼涌現(xiàn)。其中，多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multiple polymerase chain reaction，mPCR）法因靈敏度高、特異性強(qiáng)，引起了廣泛的關(guān)注。Feng等[29]通過(guò)mPCR快速檢測(cè)了多種高致病性單增李斯特菌，基因組DNA的檢出限為291 fg/?L，細(xì)菌懸液中檢出限為5.5×106 CFU/mL。此外，以人工接種單增李斯特菌的豬肉為對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，分析時(shí)間為10～16 h，在1.8×102～1.8×103 CFU/10 g的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。Alía等[30]建立了四重qPCR技術(shù)，用以鑒別從肉類加工廠中分離的單增李斯特菌株的4 種主要血清型，分析時(shí)間和成本大大降低。該方法可用于肉品工業(yè)中單增李斯特菌污染源的鑒定，以及肉品加工過(guò)程中持久性菌株的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

3.1.2? ?等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增作為一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，特點(diǎn)在于其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定溫度下，僅需簡(jiǎn)單的恒溫儀器如熱塊或水浴鍋等的輔助即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，大大降低了成本以及對(duì)精密溫控設(shè)備的依賴，已成為PCR擴(kuò)增的替代性選擇[31]。常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（single primer isothermal amplification，SPIA）以及解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)（helicase-dependent amplification，HDA）等[32]。Ledlod等[33]利用LAMP和雙向側(cè)流試紙（duplex lateral flow dipstick，DLFD）相結(jié)合的方法定量檢測(cè)了肉品中的單增李斯特菌，檢測(cè)時(shí)間為45 min。同時(shí)，與未經(jīng)LAMP預(yù)富集處理的檢測(cè)方法相比（檢出限4000 CFU/g），結(jié)合LAMP預(yù)富集的檢測(cè)方法靈敏度大大提升，檢出限最低可達(dá)20CFU/g。同時(shí)，該方法檢測(cè)單個(gè)樣品的成本僅為商用化試劑盒的一半，適用于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。Chen等[34]建立了一種基于嗜熱解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的豬肉制品金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法（圖1）。該方法利用表面包裹二氧化硅的磁性納米顆粒非特異性分離富集細(xì)菌裂解液中的DNA，并通過(guò)HDA法對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示在102～104 CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限低至50 CFU/mL。

3.1.3? ?DNA微陣列

DNA微陣列，又名DNA芯片，是一種基于基因測(cè)序的新型物種鑒定技術(shù)，利用在數(shù)平方厘米面積的基材上以特定順序排列形成的特異性寡核苷酸探針二維高密度矩陣，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)，在鑒定肉品中不同種屬致病菌等方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。Raji等[35]利用DNA微陣列技術(shù)對(duì)沙特阿拉伯利雅得零售生肉樣本中分離得到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分子診斷。對(duì)比禽肉、駱駝肉、羊肉和牛肉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)易感甲氧西林金黃色葡萄球菌對(duì)駱駝肉的污染率最高，為28%，而在牛肉中未檢出;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對(duì)駱駝肉的污染率最高，為20%，對(duì)禽肉污染率最低，為4%。

3.2? ?免疫分析法

免疫分析法以致病菌或菌的菌毛蛋白、脂多糖及其毒素為抗原[36]，利用相應(yīng)的抗體或適配體對(duì)其進(jìn)行特異性識(shí)別和定量檢測(cè)。除了經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附法，近年來(lái)與層析技術(shù)、傳感器技術(shù)、芯片技術(shù)等方法聯(lián)用的免疫分析技術(shù)在肉品食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

3.2.1? ?酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的技術(shù)。Zhu等[37]建立了一種靈敏的雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞個(gè)數(shù)，在磷酸鹽緩沖液中可直接檢測(cè)到濃度低至0.9×103 cell/mL的蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞，線性范圍約為1×104～2.8×106 cell/mL，在碎肉末樣品中的回收率為94.9%～98.4%。Zhao等[38]構(gòu)建了一種微流控蠟印紙基ELISA（paper-based ELISA，P-ELISA）法用以快速檢測(cè)牛肉中的大腸桿菌O157：H7。該方法檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)3 h，樣品用量低至5 ?L，檢出限達(dá)104 CFU/mL，與常規(guī)ELISA相比靈敏度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。進(jìn)一步對(duì)人工接種大腸桿菌O157：H7并富集培養(yǎng)8 h后的牛肉樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度可達(dá)1 CFU/25 g。

3.2.2? ?免疫層析法

免疫層析法（immunochromatographic assay，ICA）是一種利用膠體金等顯色標(biāo)記物通過(guò)夾心免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)特異性免疫診斷的檢測(cè)技術(shù)。Jiang等[39]開(kāi)發(fā)了一種新型免疫層析測(cè)定法，利用具有高過(guò)氧化物酶活性的鉑-金雙金屬納米粒子檢測(cè)大腸桿菌O157：H7。即使在低濃度范圍內(nèi)，該方法也可在不到1 min的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的可見(jiàn)光信號(hào)，與傳統(tǒng)的納米金試紙條相比，靈敏度提高了1000倍以上。肉品作為一個(gè)復(fù)雜基質(zhì)，其中的碳水化合物、脂肪以及氯化鈉和賴氨酸等成分能抑制抗體的特異性結(jié)合進(jìn)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[40]。Bu等[41]建立了一種基于免疫磁珠分離法及側(cè)向流動(dòng)免疫層析（lateral flow immunoassays，LFIA）技術(shù)的腸炎沙門氏菌檢測(cè)方法，可有效分離富集肉品中的目標(biāo)菌細(xì)胞（圖2）。首先利用表面包覆氨芐西林抗生素的磁性納米顆粒捕獲腸炎沙門氏菌，并通過(guò)與試紙條上的單克隆抗體形成夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的定量檢測(cè)。該方法僅靠肉眼觀察即可判別出102～103 CFU/mL腸炎沙門氏菌的存在，在豬肉樣品中的靈敏度為103 CFU/mL。

3.2.3? ?免疫傳感器

免疫傳感器集傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)方法和生物傳感器技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，被視為是食源性致病菌檢測(cè)的高潛力途徑。比如，可視化傳感器可利用自身色彩鮮明或具有類似過(guò)氧化物酶活性的納米材料的顏色變化，通過(guò)比色法對(duì)目標(biāo)致病菌進(jìn)行定性及定量檢測(cè)[42-43]。Díaz-Amaya等[44]研究了一種基于噴墨印刷納米圖案的光學(xué)適配體傳感器定量檢測(cè)大腸桿菌O157：H7，在絞碎的牛肉末中的檢出限為233 CFU/mL，并成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157：H7在屬、種、菌株和血清型水平上的高特異性鑒別。Xu等[45]結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)及電化學(xué)傳感技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測(cè)，兩者在菌液中的特異性檢測(cè)范圍均為102～106 CFU/mL，在牛肉末中大腸桿菌O157：H7的檢出限為2.05×103 CFU/g，在雞肉漂洗水中鼠傷寒沙門氏菌的檢出限為1.04×103 CFU/mL。

3.2.4? ?免疫芯片法

免疫芯片因具有微型化、自動(dòng)化及集成化等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)成為生化分析的研究熱點(diǎn)。其中，微流控芯片是一類通過(guò)對(duì)微米尺度通道內(nèi)液體進(jìn)行操縱和控制實(shí)現(xiàn)樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等流程的微型系統(tǒng)，具有高通量、高效率和易操作的特點(diǎn)[46]。Hao等[47]利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌的快速自動(dòng)化檢測(cè)。該方法首先將表面修飾有量子點(diǎn)和多克隆抗體的MnO2納米花與樣品和磁性微粒共同注射到微流控芯片中，在充分混合及孵育后，利用外加磁場(chǎng)將磁性微粒-目標(biāo)菌-納米花復(fù)合體分離到特定腔室內(nèi)，隨后向芯片注射谷胱甘肽溶液，將MnO2納米花分解為Mn2+，釋放量子點(diǎn)。利用量子點(diǎn)的熒光信號(hào)可實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的定量分析，檢出限低至43 CFU/mL，在加標(biāo)雞肉中的平均回收率為99.7%。

3.3? ?光譜檢測(cè)法

光譜技術(shù)是一種具有非侵入性和非破壞性特征的檢測(cè)方法，具有快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，適用于肉品中食源性致病菌的現(xiàn)場(chǎng)在線監(jiān)測(cè)[23]。目前已有將近紅外光譜（near infrared spectrum，NIRS）、表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman spectroscopy，SERS）及熒光光譜等技術(shù)應(yīng)用于肉品致病菌檢測(cè)的報(bào)道。

3.3.1? ?近紅外光譜法

近紅外光譜技術(shù)利用近紅外光照射樣品后收集到的分子旋轉(zhuǎn)及振動(dòng)相關(guān)特征信息實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的檢測(cè)，具有無(wú)需或只需少量準(zhǔn)備工作即可對(duì)各種樣品進(jìn)行非接觸分析的優(yōu)點(diǎn)。但其存在化學(xué)特異性較差，光譜解譜困難等不足[48-49]。Bonah等[50]建立了一種可見(jiàn)-近紅外高光譜成像系統(tǒng)，結(jié)合偏最小二乘回歸算法，快速監(jiān)測(cè)新鮮豬肉中的大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌。該方法可以提供豬肉樣品表面致病菌的濃度和分布，是評(píng)估肉品質(zhì)量和安全性的高潛力途徑。

3.3.2? ?表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜法利用金屬納米結(jié)構(gòu)對(duì)拉曼信號(hào)的增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)待檢物的高靈敏分析。研究表明相較于單分子拉曼信號(hào)，SERS法信號(hào)增強(qiáng)可高達(dá)1014倍[51]。Cho等[52]利用SERS技術(shù)快速檢測(cè)了牛肉末中的大腸桿菌O157：H7。通過(guò)結(jié)合免疫磁珠和膜過(guò)濾法，可從復(fù)雜樣品中快速捕獲、分離和富集目標(biāo)菌，檢測(cè)時(shí)間小于3 h，檢出限低于10 CFU/mL，靈敏度高。

3.3.3? ?熒光光譜法

熒光光譜可提供較多的微生物相關(guān)生理或過(guò)程狀態(tài)的物理參數(shù)，較少的樣品量即可實(shí)現(xiàn)肉品中致病菌快速、自動(dòng)化在線監(jiān)測(cè)[53]。Durek等[54]利用熒光光譜法對(duì)肉品表面的致病菌污染進(jìn)行了無(wú)損監(jiān)測(cè)，成功在5℃下貯存20 d的豬肉和羊肉樣品中檢出了原卟啉和鋅卟啉的熒光，并證實(shí)這些卟啉熒光信號(hào)主要是由于肉品表面滋生的不同微生物相互作用而引起的。研究結(jié)果表明該方法可應(yīng)用于鮮肉制品生產(chǎn)線和貿(mào)易線的致病菌污染監(jiān)測(cè)。

3.4? ?電子鼻檢測(cè)法

電子鼻是一種能夠快速指示樣品中隱含的特征化學(xué)氣體的傳感器，通過(guò)直接識(shí)別肉品中的細(xì)菌種群以評(píng)估肉品的安全性，已成功應(yīng)用于肉品質(zhì)量的快速監(jiān)控[55]。Timsorn等[56]建立了一種基于8 種金屬氧化物傳感器的新型便攜式電子鼻系統(tǒng)（圖3），可用于評(píng)估雞肉的新鮮度，并分別檢測(cè)在4 ℃和30 ℃下貯存貯存5 d的雞肉上已知細(xì)菌污染物的數(shù)量。構(gòu)建的電子鼻傳感器能較好地評(píng)價(jià)雞肉的細(xì)菌種群數(shù)量，相關(guān)系數(shù)較高，達(dá)0.94，均方誤差為0.016。該技術(shù)響應(yīng)時(shí)間短、檢測(cè)速度快、評(píng)估范圍廣，可以識(shí)別不同致病菌不同生長(zhǎng)階段產(chǎn)生的化學(xué)氣味，有望發(fā)展為一種同時(shí)獲取多項(xiàng)生物信息的新型途徑。肉品食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究如表2所示。

4 結(jié) 語(yǔ)

現(xiàn)階段，傳統(tǒng)生化法仍是食源性致病菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但其操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足肉類行業(yè)現(xiàn)代化高速發(fā)展的需要。近年來(lái)，在肉品食用安全保障需求下，涌現(xiàn)了大量的新型食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)。其中，分子診斷法在肉品致病菌的檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛，靈敏度高，特異性強(qiáng)，適合定量分析復(fù)雜肉品，但是存在無(wú)法區(qū)分活死致病菌的局限性，易造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[60]。此外，分子診斷法對(duì)樣品預(yù)處理、引物設(shè)計(jì)的要求較為嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜不適用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)。免疫分析法依賴于抗原抗體等的特異性結(jié)合作用，目前技術(shù)發(fā)展較為成熟，但仍存在如抗體成本高、適配體種類有限等問(wèn)題。光譜檢測(cè)法和電子鼻檢測(cè)法無(wú)需復(fù)雜耗時(shí)的前處理過(guò)程，是一種無(wú)損檢測(cè)法，可脫離實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，為實(shí)現(xiàn)肉品中食源性致病菌的實(shí)時(shí)原位在線監(jiān)測(cè)和自動(dòng)化采樣監(jiān)測(cè)提供有效途徑。

開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、高效、靈敏的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障肉品安全和消費(fèi)者健康至關(guān)重要。在今后的研究中，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)以下方面更為深入的探索：1）肉品基質(zhì)復(fù)雜，亟需發(fā)展快速有效的樣品前處理技術(shù)，以替代漫長(zhǎng)繁瑣的增菌步驟;2）如何在保證精準(zhǔn)性的同時(shí)，提升檢測(cè)速度，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)和快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè);3）如何構(gòu)建輕量化、一體化及智能化的檢測(cè)設(shè)備，通過(guò)與大數(shù)據(jù)、人工智能及物聯(lián)網(wǎng)等技術(shù)聯(lián)用，為產(chǎn)業(yè)監(jiān)控提供技術(shù)支撐;4）如何處理檢測(cè)完畢后的廢棄物，避免致病菌二次污染等。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國(guó)統(tǒng)計(jì)局. 中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京： 中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社， 2020.

[2] 付萍， 王連森， 陳江， 等. 2015年中國(guó)大陸食源性疾病暴發(fā)事件監(jiān)測(cè)資料分析[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志， 2019， 31（1）： 64-70. DOI：10.13590/j.cjfh.2019.01.014.

[3] 李可維， 劉思潔， 趙薇， 等. 9274份肉及肉制品食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， 2020， 11（23）： 9033-9038. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.23.077.

[4] PATEIRO M， MUNEKATA P E S， SANTANA A S， et al. Application of essential oils as antimicrobial agents against spoilage and pathogenic microorganisms in meat products[J]. International Journal of Food Microbiology， 2021， 337： 108966. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108966.

[5] 蔡潔. 我國(guó)肉類食品微生物安全現(xiàn)狀及控制檢測(cè)技術(shù)[J]. 中外企業(yè)家， 2018， 595（5）： 222. DOI：CNKI：SUN：ZWQY.0.2018-05-178.

[6] 謝雨龍， 覃巧思， 李佳連. 沙門氏菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 輕工科技， 2020， 36（9）： 139-141. DOI：CNKI：SUN：GXQG.0.2020-09-056.

[7] 王霄曄， 任婧寰， 王哲， 等. 2017年全國(guó)食物中毒事件流行特征分析[J]. 疾病監(jiān)測(cè)， 2018， 33（5）： 359-364. DOI：CNKI：SUN：JBJC.0.2018-05-005.

[8] 王霄曄， 吳曉旻， 王銳， 等. 2018年第三季度全國(guó)食物中毒事件流行特征分析[J]. 疾病監(jiān)測(cè)， 2019， 34（8）： 741-745. DOI：CNKI：SUN：JBJC.0.2018-06-004.

[9] 吳得海. 食品安全事件之警示與思考[M]. 甘肅： 文化出版社， 2016.

[10] 孔祥瑞， 王洪柱. 金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)乳業(yè)， 2017， （10）： 72-74. DOI：10.16172/j.cnki.114768.2017.10.020.

[11] 梁金姬， 宋德涵， 李韻辭， 等. 金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 山東化工， 2015， 44（10）： 41-42. DOI：10.3969/j.issn.1008-021X.2015.10.013.

[12] KARTHIKEYANA R， GAYATHRIB P， GUNASEKARAN P， et al. Comprehensive proteomic analysis and pathogenic role of membrane vesicles of Listeria monocytogenes serotype 4b reveals proteins associated with virulence and their possible interaction with host[J]. International Journal of Medical Microbiology， 2019， 309（3-4）： 199-212. DOI：10.1016/j.ijmm.2019.03.008.

[13] SILVA N F D， NEVES M M P S， MAGALHES J M C S， et al. Emerging electrochemical biosensing approaches for detection of Listeria monocytogenes in food samples： an overview[J]. Trends in Food Science & Technology， 2020， 99： 621-633. DOI：10.1016/j.tifs.2020.03.031.

[14] 宋筱瑜， 裴曉燕， 徐海濱， 等. 我國(guó)零售食品單增李斯特菌污染的健康風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)研究[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志， 2015， 27（4）： 447-450. DOI：10.13590/j.cjfh.2015.04.021.

[15] 殷澤祿， 萬(wàn)虎. 大腸桿菌的研究綜述[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)， 2019， 49（5）： 33-35. DOI：10.15979/j.cnki.cn62-1064/s.2019.05.010.

[16] 韓海燕， 蔡擴(kuò)軍， 王承. 大腸桿菌O157：H7的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)畜牧業(yè)， 2020， （10）： 50. DOI：CNKI：SUN：MYTX.0.2020-10-021.

[17] 于旭磊. 產(chǎn)氣莢膜梭菌流行特點(diǎn)及其噬菌體遺傳背景分析[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2020： 1. DOI：10.27277/d.cnki.gsdnu.2020.000354.

[18] LI L， VALENZUELA-MARTINEZ C， REDONDO M， et al. Inhibition of Clostridium perfringens Spore Germination and Outgrowth by Lemon Juice and Vinegar Product in Reduced NaCl Roast Beef[J]. Journal of Food Science， 2012， 77（11）： M598-M603. DOI：10.1111/j.1750-3841.2012.02922.x.

[19] 黃亞奇， 熊靜禹， 沈達(dá)， 等. 空腸彎曲桿菌毒力因子及其致病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)家禽， 2019， 41（22）： 46-51. DOI：10.16372/j.issn.1004-6364.2019.22.010.

[20] 陽(yáng)成波， 蔣原， 黃克和. 空腸彎曲桿菌感染流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2002（6）： 10-12. DOI：10.16437/j.cnki.1007-5038.2002.06.004.

[21] 金星. 乳酸菌拮抗空腸彎曲桿菌的機(jī)制研究[D]. 無(wú)錫： 江南大學(xué)， 2020： 1. DOI：10.27169/d.cnki.gwqgu.2020.000853.

[22] 姬莉莉， 閆雪. 食品中微生物限量要求及檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)[J]. 2021， 12（2）： 460. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.02.008.

[23] 王成， 陸雨菲， 劉箐. 光譜技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 光學(xué)儀器， 2019， 41（1）： 85-94. DOI：CNKI：SUN：GXYQ.0.2019-01-015.

[24] 鄭桂麗， 廖紹安， 翟俊輝， 等. 環(huán)境中"活的非可培養(yǎng)（VBNC）"細(xì)菌的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2004， 32（4）： 58-66. DOI：10.3969/j.issn.1005-5673.2004.04.016.

[25] KUMAR Y. Isothermal amplification-based methods for assessment of microbiological safety and authenticity of meat and meat products[J]. Food Control， 2021， 121： 107679. DOI：10.1016/j.foodcont.2020.107679.

[26] UMESHA S， MANUKUMAR H M. Advanced Molecular Diagnostic Techniques for Detection of Food-borne Pathogens; Current Applications and Future Challenges[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition， 2018， 58（1）： 84-104. DOI：10.1080/10408398.2015.1126701.

[27] CAPOBIANCO J A， CLARK M， CARIOU A， et al. Detection of Shiga toxin producing Escherichia coli （STEC） in beef products using droplet digital PCR[J]. International Journal of Food Microbiology， 2019， 319： 108499. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2019.108499.

[28] LIU Y， CAO Y， WANG T， et al. Detection of 12 Common Food-Borne Bacterial Pathogens by TaqMan Real-Time PCR Using a Single Set of Reaction Conditions[J]. Frontiers in microbiology， 2019， 10： 222. DOI：10.3389/fmicb.2019.00222.

[29] FENG Y W， YAO H， CHEN S S， et al. Rapid Detection of Hypervirulent Serovar 4h Listeria monocytogenes by Multiplex PCR[J]. Frontiers in Microbiology， 2020， 11： 1309. DOI：10.3389/FMICB.2020.01309.

[30] AL?A A， ANDRADE M J， CORDOBA J J， et al. Development of a multiplex real-time PCR to differentiate the four major Listeria monocytogenes serotypes in isolates from meat processing plants[J]. Food microbiology， 2020， 87： 103367. DOI：10.1016/j.fm.2019.103367.

[31] 王瑞. 快速核酸擴(kuò)增及可視化策略用于食源性致病菌和轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2019： 16. DOI：10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.000339.

[32] REID M S， LE X C， ZHANG H. Exponential Isothermal Amplification of Nucleic Acids and Assays for Proteins， Cells， Small Molecules， and Enzyme Activities： An EXPAR Example[J]. Angewandte Chemie International Edition， 2018， 57（37）： 11856-11866. DOI：10.1002/anie.201712217.

[33] LEDLOD S， BUNRODDITH K， AREEKIT S， et al. Development of a duplex lateral flow dipstick test for the detection and differentiation of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in meat products based on loop-mediated isothermal amplification[J]. Journal of chromatography. B， Analytical technologies in the biomedical and life sciences， 2020， 1139（C）： 121834. DOI：10.1016/j.jchromb.2019.121834.

[34] CHEN X， WU X， GAN M， et al. Rapid detection of Staphylococcus aureus in dairy and meat foods by combination of capture with silica-coated magnetic nanoparticles and thermophilic helicase-dependent isothermal amplification[J]. Journal of Dairy Science， 2015， 98（3）： 1563-1570. DOI：10.3168/jds.2014-8828.

[35] RAJI M A， GARAWEEN G， EHRICHT R， et al. Genetic Characterization of Staphylococcus aureus Isolated from Retail Meat in Riyadh， Saudi Arabia[J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 7： 911. DOI：10.3389/fmicb.2016.00911.

[36] 解沛燕， 朱龍佼， 許文濤. 適配體在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2016， 32（4）： 48-62. DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.006.

[37] ZHU L， HE J， CAO X， et al. Development of a double-antibody sandwich ELISA for rapid detection of Bacillus Cereus in food[J]. Rep， 2016， 6（1）： 16092. DOI：10.1038/srep16092.

[38] ZHAO Y， ZENG D， YAN C， et al. Rapid and accurate detection of Escherichia coli O157：H7 in beef using microfluidic wax-printed paper-based ELISA[J]. The Analyst， 2020， 145（8）： 3106-3115. DOI：10.1039/d0an00224k.

[39] JIANG T， SONG Y， WEI T， et al. Sensitive detection of Escherichia coli O157：H7 using Pt-Au bimetal nanoparticles with peroxidase-like amplification[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2016， 77： 687-694. DOI：10.1016/j.bios.2015.10.017.

[40] WANG Z， CAI R， GAO Z， et al. Immunomagnetic separation： An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 19（6）： 3802-3824. DOI：10.1111/1541-4337.12656.

[41] BU T， YAO X， HUANG L， et al. Dual recognition strategy and magnetic enrichment based lateral flow assay toward Salmonella enteritidis detection[J]. Talanta， 2020， 206（C）： 120204. DOI：10.1016/j.talanta.2019.120204.

[42] 周靜， 田風(fēng)玉， 焦必寧， 等. 基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2019， 45（11）： 259-267. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019960.

[43] ALHOGAIL S， SUAIFAN G A R Y， ZOUROB M. Rapid colorimetric sensing platform for the detection of Listeria monocytogenes foodborne pathogen[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2016， 86： 1061-1066. DOI：10.1016/j.bios.2016.07.043.

[44] D?AZ-AMAYA S， ZHAO M， LIN L， et al. Inkjet Printed Nanopatterned Aptamer-Based Sensors for Improved Optical Detection of Foodborne Pathogens[J]. Small， 15（24）： 1805342. DOI：10.1002/smll.201805342.

[45] XU M， WANG R， LI Y. Rapid detection of Escherichia coli O157：H7 and Salmonella Typhimurium in foods using an electrochemical immunosensor based on screen-printed interdigitated microelectrode and immunomagnetic separation[J]. Talanta， 2016， 148： 200-208. DOI：10.1016/j.talanta.2015.10.082.

[46] 王楷宬， 孫瑞妮， 姜楠， 等. 微流控芯片技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2021， 38（1）： 93-99. DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.01.018.

[47] HAO L， XUE， HUANG F， et al. A Microfluidic Biosensor Based on Magnetic Nanoparticle Separation， Quantum Dots Labeling and MnO2 Nanoflower Amplification for Rapid and Sensitive Detection of Salmonella typhimurium[J]. Micromachines， 2020， 11（3）： 281-296. DOI：10.3390/mi11030281.

[48] TOLEDO M， GUTI?RREZ M C， SILES J A， et al. Chemometric analysis and NIR spectroscopy to evaluate odorous impact during the composting of different raw materials[J]. Journal of Cleaner Production， 2017， 167： 154-162. DOI：10.1016/j.jclepro.2017.08.163.

[49] KRZYSZTOF B B， JUSTYNA G， CHRISTIAN W H， et al. Near-Infrared Spectroscopy in Bio-Applications[J]. Molecules， 2020， 25（12）： 2948. DOI：10.3390/molecules25122948.

[50] BONAH E， HUANG X Y， AHETO J H， et al. Comparison of variable selection algorithms on vis-NIR hyperspectral imaging spectra for quantitative monitoring and visualization of bacterial foodborne pathogens in fresh pork muscles[J]. Infrared Physics & Technology， 2020， 107： 103327. DOI：10.1016/j.infrared.2020.103327.

[51] POLISETTI S， BAIG N F， MORALES-SOTO N， et al. Spatial Mapping of Pyocyanin in Pseudomonas Aeruginosa Bacterial Communities Using Surface Enhanced Raman Scattering[J]. Applied Spectroscopy， 2017， 71（2）： 215-223. DOI：10.1177/0003702816654167.

[52] CHO I， BHANDARI P， PATEL P， et al. Membrane filter-assisted surface enhanced Raman spectroscopy for the rapid detection of E. coli O157：H7 in ground beef[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2015， 64： 171-176. DOI：10.1016/j.bios.2014.08.063.

[53] FAASSEN S， HITZMANN B. Fluorescence spectroscopy and chemometric modeling for bioprocess monitoring[J]. Sensors， 2015， 15（5）： 10271-10291. DOI：10.3390/s150510271.

[54] DUREK J， FR?HLING A， BOLLING J， et al. Non-destructive mobile monitoring of microbial contaminations on meat surfaces using porphyrin fluorescence intensities[J]. Meat Science， 2016， 115： 1-8. DOI：10.1016/j.meatsci.2015.12.022.

[55] 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督行業(yè)職業(yè)技能鑒定指導(dǎo)中心. 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督基礎(chǔ)[M]. 2版. 中國(guó)質(zhì)檢出版社， 2014.

[56] TIMSORN K， THOOPBOOCHAGORN T， LERTWATTANASAKUL N， et al. Evaluation of bacterial population on chicken meats using a briefcase electronic nose[J]. Biosystems Engineering， 2016， 151： 116-125. DOI：10.1016/j.biosystemseng.2016.09.005.

[57] HASSAN A H A， BERGUA J F， MORALES-NARV?EZ E， et al. Validity of a single antibody-based lateral flow immunoassay depending on graphene oxide for highly sensitive determination of E. coli O157：H7 in minced beef and river water[J]. Food Chemistry， 2019， 297： 124965. DOI：10.1016/j.foodchem.2019.124965.

[58] ZHUANG L， GONG J， JI Y， et al. Lateral Flow Fluorescent Immunoassay Based on Isothermal Amplification for Rapid Quantitative Detection of Salmonella spp.[J]. The Analyst， 2020， 145（6）： 2367-2377. DOI：10.1039/C9AN02011J.

[59] MUNIANDY S， DINSHAW I J， TEH S J， et al. Graphene-based label-free electrochemical aptasensor for rapid and sensitive detection of foodborne pathogen[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry， 2017， 409（29）： 6893-6905. DOI：10.1007/s00216-017-0654-6.

[60] 王琦， 顏春蕾， 高洪偉， 等. 基于核酸適配體傳感器檢測(cè)食品致病菌的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2020， 36（11）： 245-258. DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1273.