黑喉石斛DoFT1基因在花發(fā)育過程中的表達模式分析及功能驗證

杜致輝 楊瀾 姚新轉 陳之林

摘 ?要：FT（FLOWERING LOCUS T）基因是植物開花調控過程中的關鍵整合基因。為探明黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）FT同源基因功能及其在黑喉石斛嫩莖開花過程中扮演的角色，本研究以黑喉石斛為試驗材料，基于轉錄組測序結果，克隆得到黑喉石斛FT同源基因，命名為DoFT1。DoFT1基因編碼區(qū)長度為537?bp，共編碼178個氨基酸;生物信息學分析結果表明，該基因編碼的蛋白屬于PEBP家族蛋白，其含有關鍵保守氨基酸位點Tyr84和11個連續(xù)保守氨基酸殘基序列，為FT同源基因;進化樹分析結果顯示，DoFT1氨基酸序列與鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭同源基因親緣關系較近;Real-time PCR分析結果顯示，DoFT1主要在黑喉石斛葉片部位表達，其表達量在花芽開始分化階段出現(xiàn)上調，并在花芽成熟期達到峰值后呈下降趨勢;將DoFT1導入煙草中超量表達，可以顯著促進煙草提前開花。

關鍵詞：黑喉石斛;DoFT1基因;嫩莖開花;成花誘導中圖分類號：Q789??????文獻標識碼：A

Expression Pattern Analysis of Dendrobium ochreatum?DoFT1 Gene During Flower Development and Its Functional Verification

DU Zhihui¹， YANG Lan¹， YAO Xinzhuan²， CHEN Zhilin^1*

1. Guizhou Horticulture Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 2. Tea College， Guihzou University， Guiyang， Guizhou 550025， China

Abstract： TheFLOWERING LOCUS T （FT） gene plays a key role in integrating flowering signals in plants.To study the function of the?FT homologous gene and its role in tender stem flowering ofDendrobium Ochreatum， theFT homologous gene， named asDoFT1， was cloned from?Den. Ochreatumon the basis of transcriptome sequencing results.DoFT1 contained a 537 bp open reading frame which encoding 178 amino acids. Bioinformatic analysis showed that the DoFT1 belonged to the PEBP family， the conserved key amino acid residue Tyr84 and 11-AA stretch of?FT homologs were identified in DoFT1. Phylogenetic tree results showed that DoFT1 was closely related to DcFT inDendrobium candidum and PeFT inPhalaenopsis Equestris. Real-time PCR results indicated that the expression ofDoFT1 was mainly located in leaf tissues， and its expression level was up-regulated during the flower bud differentiation?phase， then showed a downward trend after reaching its peak at the flower bud phase. Over-expression ofDoFT1 in transgenic tobacco plants resulted in earlier flowering compared to wild-type plants.

Keywords： Dendrobium ochreatum;DoFT1gene; tender stem flowering; flower induction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.006

黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）多年生附生草本植物^[1]，屬于春石斛。相比于大多石斛只能在2年生老莖上開花，黑喉石斛在新長出的嫩莖上就能抽出花序并開花^[2]，其開花時間明顯早于其他春石斛，是珍貴的育種親本，也是研究石斛早開花機理的重要材料。

花期調控是石斛生產(chǎn)中的關鍵技術，也是近年研究的熱點^[3]。花發(fā)育主要分為成花誘導、花發(fā)端及花器官發(fā)育3個階段。其中，植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉換即成花誘導是植物發(fā)育中最顯著的過程，也是植物繁殖的關鍵事件^[4-6]。在成花誘導過程中已知的成花誘導途徑有光周期途徑（photoperiodic pathway）、春化途徑（vernalization pathway）、赤霉素途徑（GA gibberellin pathway）和自主調控途徑（autonomous pathway）等^[7-8]。而FT作為開花途徑中的重要整合因子，其同源基因的結構與功能在不同物種之間高度保守。

目前關于FT及其相關基因在擬南芥等模式植物開花過程中的表達模式與作用機制的研究已較為深入，FT作為多條開花途徑的信號整合因子受其上游基因CO的調控，在植物葉片中表達后通過韌皮部運輸至莖尖分生組織，結合FD蛋白后激活其下游基因AP1和SOC1的表達，進而調控植物的成花轉變^[9]。而在蘭科植物的相關研究中，Li等^[10]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超量表達金釵石斛DnFT基因可以通過調控AP1和LHY促進擬南芥提前開花。孫崇波等^[11]的研究表明轉蕙蘭CfFT基因煙草植株的開花提前時間與該基因在轉化植株中的表達量呈正相關。黃瑋婷等^[12]發(fā)現(xiàn)墨蘭CsFT基因具有擬南芥同源基因類似的促進開花的作用。但關于黑喉石斛FT同源基因功能的研究仍未見報道。

本實驗室前期對黑喉石斛轉錄組數(shù)據(jù)分析結果顯示，FT同源基因同時參與了生物節(jié)律鐘、光周期、生殖轉換3個開花重要生物過程。所以，本研究以黑喉石斛為材料，克隆得到了其FT同源基因DoFT1，分析該基因在黑喉石斛開花前后不同部位的表達模式，并進一步構建超量表達載體遺傳轉化煙草，對其功能進行初步驗證。為明確其在黑喉石斛成花誘導過程中的作用，探明黑喉石斛開花機制提供新的參考。

1??材料與方法

1.1材料

本研究所用材料黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）由貴州省園藝研究所保存并提供。植物表達載體pSH 737、農(nóng)桿菌LBA 4404、普通煙草（Nicotiana tabacumL.）栽培品種‘Xanthi由貴州大學山地植物資源保護與種質創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室提供。

1.2方法

1.2.1?DoFT1的克隆??結合轉錄組測序結果和GenBank中多個FT同源基因序列比對結果，使用DNASTAR設計PCR擴增引物。DoFT F：5?-?GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGA-3?，DoFT R：5?-CGTACCGAATTCGAGCTCGGTACC-3?，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以黑喉石斛不同時期葉片cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為：cDNA 1?μL、上游引物DoFT F 1?μL、下游引物DoFT R 1?μL、PCR Mix 10?μL和ddH₂O 7?μL，共20?μL。PCR擴增反應程序為：94?℃?5?min預變性;94?℃?30?s，55?℃?40?s，72?℃?1?min，35個循環(huán);72?℃延伸3?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行膠回收實驗并連接T₄載體，遺傳轉化大腸桿菌感受態(tài)并送出測序。拼接測序結果后獲得該基因cDNA全長序列。

1.2.2?DoFT1的生物信息學分析??采用BALST分析DoFT1基因的氨基酸序列同源性，下載相似性較高的其他植物同源氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件根據(jù)相鄰連接方法（neighbor jointing，NJ）構建DoFT1系統(tǒng)進化樹并分析;通過ExPASy Proteomics Server在線軟件ProtParam分析其理化性質，分別使用SOMPA和SWISS MODEL預測其二、三級結構。

1.2.3?DoFT1及其相關基因的表達模式分析??采用華越洋RNA提取試劑盒分別提取黑喉石斛營養(yǎng)生長階段、花芽分化階段、花芽階段和開花階段4個階段的總RNA，逆轉錄為cDNA備用。采用實時熒光定量PCR方法檢測DoFT1基因的表達情況，根據(jù)DoFT1基因的cDNA全長序列，運用DNASTAR設計實時熒光定量PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實時熒光定量PCR反應體系為：SYBR Premix Ex?Taq（2×） 10?μL、上游引物DoFT1 RF 1?μL、下游引物DoFT RR 1?μL、cDNA 1?μL、ddH₂O 7 μL，共20?μL。于冰上配制反應液，置于實時熒光定量PCR儀上進行反應，每個樣品3次重復。反應完成后計算基因的相對表達量。

1.2.4 ?轉DoFT1基因植株的獲得及開花觀察期 ?獲得DoFT1編碼區(qū)序列后，在其5?端和3?分別加入XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點序列，送由上海旭冠生物公司合成后通過雙酶切反應連接至pSH 737植物表達載體，得到pSH-35S-DoFT載體，該載體含有35S啟動子驅動的GUS：：NPT II作為報告基因。通過凍融法導入農(nóng)桿菌LBA 4404，以葉盤法遺傳轉化模式植物煙草。對經(jīng)過鑒定的轉基因煙草植株開花情況進行觀察。

2 ?結果與分析

2.1黑喉石斛DoFT1基因序列全長克隆及分析

以黑喉石斛不同時期葉片cDNA為模板，結合轉錄組測序拼接結果和GenBank中多個FT同源基因序列設計特異引物，經(jīng)過PCR擴增后，得到一條約500?bp大小的基因片段，與預期結果一致（圖1）。PCR擴增產(chǎn)物膠回收后，連接T載體后測序，拼接后獲得黑喉石斛FT基因cDNA全長序列585?bp。序列分析結果表明，該基因包含1個長度為537?bp的完整開放閱讀框， 編碼178個氨基酸殘基。

其氨基酸序列BLAST比對結果表明（圖2），該基因氨基酸序列包含DPPAP和GIHR等模塊，

具有磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidyletha- nolamine-binding protein， PEBP）家族典型功能結構域。進一步比對其與2個蘭科近緣物種氨基酸序列（圖3），發(fā)現(xiàn)其含有關鍵保守氨基酸位點Tyr84和對FT活性起關鍵作用的11個保守氨基酸殘基序列，為FT同源基因，命名為DoFT1。

DoFT1編碼的蛋白質分子式為C₈₈₇H₁₃₆₅N₂₅₁O₂₅₇S₇，原子總數(shù)為2767，預測其相對分子質量為19.88?kDa，等電點為5.69。分析結果顯示，此蛋白含有20個纈氨酸（Val），占氨基酸總數(shù)的11.2%;含有16個甘氨酸（Gly），占氨基酸總數(shù)

DcFT：鐵皮石斛（XP_020702366.1）;PeFT：小蘭嶼蝴蝶蘭（XP_020576922.1）;具有一致性和相似性的氨基酸分別用深藍色和淺藍色表示;方框為PEBP家族蛋白和FT蛋白保守結構域，Y為FT蛋白關鍵保守氨基酸位點Tyr84。

DcFT：Dendrobium catenatum （XP_020702366.1）; PeFT：Phalaenopsis equestris （XP_020576922.1）; The identity and similarityamino acid sequences are marked by dark blue and light blue， respectively. The boxes are conservative elements of PEBP proteinfamily and FT protein， the Y are key conservative amino acid sites Tyr84 of FT protein.的9%;不含有吡咯賴氨酸（Pyl）以及硒半胱氨酸（Sec）。親水性平均系數(shù)為–0.248，為親水性蛋白。

通過SOMPA軟件分析DoFT1蛋白二級結構，發(fā)現(xiàn)其蛋白質二級結構中含有13.48%的α-螺旋、25.84%的延伸鏈、5.06%的?β-折疊和55.62%的無規(guī)則卷曲。BLAST和SWISS-MODEL預測DoFT蛋白三級結構具有典型的PEBP基因家族蛋白質結構域，其中心具有1個大的由5個反向平行肽鏈組成的β-折疊區(qū)域。此外，其N端有1個α-螺旋、1個β-折疊，C端有1個α-螺旋。

2.2 ?黑喉石斛DoFT1基因氨基酸序列進化分析

通過NCBI中的BLAST在線軟件將DoFT1

推導的氨基酸序列進行搜索比對（圖4），發(fā)現(xiàn)DoFT1與鐵皮石斛FT基因氨基酸序列具有較高的同源性和一致性，序列一致性為96%;其次為小嶼蝴蝶蘭，其氨基酸序列一致性為94%;此外，DoFT1與月季、郁金香、水仙、蘋果等10個物種的FT氨基酸序列相似性皆在80%以上，說明FT基因在其長期進化中的保守性。采用MEGA 6.0軟件對DoFT1基因編碼的氨基酸序列和GenBank收錄的12種植物的同源序列構建系統(tǒng)進化樹，聚類后進行分析，結果表明黑喉石斛首先與小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛等蘭科植物親緣關系最為接近，然后與郁金香、菠蘿、水仙等單子葉植物FT同源氨基酸歸為一類。

2.3黑喉石斛DoFT1基因表達模式

圖5為黑喉石斛不同階段形態(tài)特征，利用Real-time PCR技術分析黑喉石斛自然開花過程不同組織中DoFT1基因的表達模式。結果表明：DoFT1基因主要在葉片中表達，隨著黑喉石斛從營養(yǎng)生長期向生殖生長期的轉換，DoFT1的表達量在花芽分化期出現(xiàn)上調，并在花芽形成期達到峰值，最終在開花期出現(xiàn)下調（圖6）。此外，開花期時，DoFT1在葉片和花器官中均有所表達，但葉片的表達量遠高于花器官，而在花芽中則未檢出DoFT1基因的表達（圖7）。

2.4黑喉石斛DoFT1基因遺傳轉化煙草及轉化植株的表型分析

將得到的抗性幼苗植株移栽至營養(yǎng)土中，取4～6葉期抗性煙苗的葉片進行GUS化學組織染色。提取GUS染色陽性植株葉片總DNA，以DoFT1基因的特異性引物進行PCR擴增，在抗性植株中擴增得到500?bp左右的特異性條帶（圖8）。經(jīng)鑒定，最終獲得20余株T₀代轉DoFT1基因煙草株系。選取其中開花較早的株系提取總RNA，反轉為cDNA后進行PCR擴增，最終篩選出2個超量表達DoFT1基因的煙草株系。

收取篩選得到的T₀代轉DoFT1基因煙草株系種子，播種后再次經(jīng)過鑒定得到T₁代轉DoFT1基因煙草植株，對其開花性狀進行觀察（圖9）。結果表明（表1），在正常光照條件下，轉基因煙草植株的開花期相比于野生型植株提前了15?d，而轉基因植株的盛開期（50%植株開花）相比于野生型提前了13?d。初步推測DoFT1基因的超量表達在正常光照條件下可以促進植株提前開花。

3??討論

目前黑喉石斛的研究主要集中在多倍體誘導^[13]和試管苗開花^[2]等技術層面，尚未見到有關其開花基因的研究報道。本實驗室前期已完成黑喉石斛無參考基因組試管開花組培苗與對照樣本的轉錄組測序工作，分析對照組差異顯著基因發(fā)現(xiàn)，有7440個基因參與到黑喉石斛花發(fā)育過程，其中直接參與成花誘導的基因有94個，包括光周期及自主途徑上的促進基因和抑制基因。如CRY1、CRY2、GI、CO、FT、FD、SOC1、LFY、AP1等促進開花轉型基因均上調，SVP、CCA1、LHY、CDF、SPA1等抑制基因顯著下調。進一步分析發(fā)現(xiàn)FT同源基因同時參與了生物節(jié)律鐘、光周期、生殖轉換3個開花重要生物過程。

為探究FT基因對黑喉石斛開花機制的調控作用，結合轉錄組測序結果在黑喉石斛葉片中克隆得到了FT同源基因DoFT1。序列BLAST結果表明，該基因的序列與鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭FT同源基因編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為96%和94%，與月季、郁金香等10種植物的相對應氨基酸序列相似性皆在80%以上，說明不同物種FT基因序列較為保守^[14]。對黑喉石斛DoFT1氨基酸序列進行生物信息學分析，結果表明該蛋白三級結構具有DDPxD和GxHR等典型PEBP家族蛋白質功能結構域^[15]，這些保守序列均與磷脂酰乙醇胺的結合位點形成有關。同源序列比對結果表明，其序列含有關鍵保守氨基酸位點Tyr84和對FT活性起關鍵作用的11個保守氨基酸殘基序列^[10]，說明本研究克隆得到的DoFT1基因為FT同源基因。

不同植物中FT同源基因的表達模式有一定區(qū)別。如擬南芥和水稻的FT同源基因在葉片中表達，其表達產(chǎn)物移動到莖尖組織之后與FLOWERING LOCUS D （FD）等蛋白結合后促進開花^[16-18];荔枝FT同源基因僅在葉片中表達，遺傳轉化模式植物煙草后部分轉基因植株出現(xiàn)早花表型^[19];而黃瓜FT同源基因在花器官和果實中表達，在葉片中不表達^[20]。本研究發(fā)現(xiàn)DoFT1基因在黑喉石斛的葉片組織中表達量最高，在花器官中表達量少，在花芽中未檢測出表達量，與擬南芥和荔枝FT同源基因的表達模式相似。不同發(fā)育時期的葉片組織中，DoFT1基因表達量在花芽始分化階段出現(xiàn)上調，在花芽形成時期的基因的表達量達到最高，開花后該基因的表達量下降。這與文心蘭OnFT基因的表達量在其葉片中隨著成熟度的增長呈現(xiàn)先升后降的表達模式相似^[14]。本研究構建了DoFT1的過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法導入煙草中。觀察T₁代轉基因煙草植株的開花性狀，發(fā)現(xiàn)其整體呈現(xiàn)早花趨勢。與擬南芥^[16]、水稻^[17-18]、蕙蘭^[11]、墨蘭^{[12， 21]}等物種中的FT同源基因具有相似的正向調控開花作用。初步推測黑喉石斛中的DoFT1可能在成花誘導和花發(fā)端過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結合轉錄組數(shù)據(jù)克隆獲得了黑喉石斛FT同源基因DoFT1序列，序列分析結果表明該基因為鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭FT基因的同源基因。熒光定量分析結果表明該基因主要在黑喉石斛葉片中表達，且在花芽分化形成期葉片中表達量最高。將DoFT1導入煙草中超量表達，可以使煙草開花時間明顯提前。該結果為探明DoFT1在黑喉石斛嫩莖成花機制中的作用提供參考。

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責任編輯：崔麗虹