聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)庫(kù)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙勇安湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

李院魏　高驥　李雙印

【摘 要】目的：聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)庫(kù)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙勇安湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要成分和可能的作用機(jī)制。方法：通過(guò)GEO芯片數(shù)據(jù)挖掘OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索收集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn);通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以生物利用度 > 30%，類藥性 > 0.18為篩選條件，收集四妙勇安湯的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將四妙勇安湯靶點(diǎn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)進(jìn)行匹配獲取靶點(diǎn)基因，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn)。使用R軟件進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。結(jié)果：四妙勇安湯有效成分共126個(gè)（如山柰酚、槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇等），對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)2044個(gè);類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)4360個(gè);中藥-疾病靶點(diǎn)匹配獲得潛在靶點(diǎn)165個(gè)。GO分析生物過(guò)程獲得通路2329個(gè)，細(xì)胞組分獲得通路89個(gè)，分子功能獲得通路163個(gè);KEGG通路分析共獲得通路160個(gè)。結(jié)論：本研究為更深層次探究四妙勇安湯及所含四妙勇安湯藥物成分方劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;四妙勇安湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號(hào)通路;靶點(diǎn);蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

On the Mechanism of Simiao Yong'an Tang（四妙勇安湯）in Treating Rheumatoid Arthritis Using Network

Pharmacology Combined with GEO Database

LI Yuan-wei，GAO Ji，LI Shuang-yin

【ABSTRACT】Objective：To explore the main components and possible mechanism of Simiao Yong'an Tang（四妙勇安湯）in the treatment of rheumatoid arthritis（RA）using network pharmacology

combined with GEO database.Methods：GEO chip database was used to mine the OMIM database and Genecards database，which were used to collect rheumatoid arthritis targets.Through TCMSP database，the bioactive components and corresponding targets of Simiao Yong'an Tang were collected under the screening conditions of bioavailability being over 30% and generic property over 0.18.The Simiao Yong'an Decoction target was matched with rheumatoid arthritis target to obtain target gene.The PPI network was constructed using software Cytoscape 3.7.2，and the core target was screened by topology analysis.Software R was used to analyze GO biological function and KEGG pathway enrichment.Results：There were 126 effective components in Simiao Yong'an Tang（such as kaempferol，quercetin，stigmasterol，β-sitosterol，sitosterol etc.）.There were 2044 corresponding targets，4360 rheumatoid arthritis targets and 165 potential targets obtained by Chinese medicine-disease target matching.Go analysis showed that there were 2329 pathways in biological process，89 pathways in cell component and 163 pathways in molecular function.A total of 160 pathways were obtained by KEGG pathway analysis.Conclusion：This study laid a foundation for further exploring the mechanism of Simiao Yong'an Tang in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;

Simiao Yong'an Tang（四妙勇安湯）;network pharmacology;signal pathway;targets;PPI network

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕關(guān)節(jié)為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。主要累及關(guān)節(jié)，也會(huì)出現(xiàn)類風(fēng)濕性結(jié)節(jié)、肺部受累血管炎，以及全身合并癥等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1]。RA屬中醫(yī)學(xué)“尪痹”“歷節(jié)病”“痹病”等范疇。RA急性期紅腫熱痛與中醫(yī)的熱痹極其相似。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，毒熱之邪注于經(jīng)絡(luò)，流入關(guān)節(jié)，使氣機(jī)阻滯，血運(yùn)不暢，導(dǎo)致紅腫熱痛。房定亞[2]提出運(yùn)用四妙勇安湯治療RA急性期熱痹證。徐國(guó)山等[3]研究表明，在西藥基礎(chǔ)上聯(lián)合四妙勇安湯類方治療RA可增強(qiáng)療效并減少不良反應(yīng)。四妙勇安湯清熱活血，尤其是RA急性期瘀熱痹阻證，臨床療效顯著。

西醫(yī)臨床常用藥物包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）。傳統(tǒng)的DMARDs[如甲氨蝶呤、Janus激酶（JAK）抑制劑等]或生物來(lái)源的DMARDs（如腫瘤壞死因子抑制劑、共刺激調(diào)節(jié)劑、白細(xì)胞介素-6抑制劑等）[4]，雖然治療RA療效顯著，但存在一定的不良反應(yīng)，且JAK抑制劑等新型藥物價(jià)格高，患者難以承受。

四妙勇安湯聯(lián)合西藥治療RA效果顯著[3]，但其作用機(jī)制尚未明確。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，為四妙勇安湯及其類方治療RA的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選RA對(duì)應(yīng)靶點(diǎn) 登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）選擇Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)芯片，獲取編號(hào)為GSE93272的芯片數(shù)據(jù)原始文件和GPL570-55999的芯片基因注釋文件，此芯片數(shù)據(jù)中包含275個(gè)樣本，其中232個(gè)來(lái)自RA患者（試驗(yàn)組），43個(gè)來(lái)自健康人群（對(duì)照組）。使用R軟件（https：//www.r-project.org/，version 3.6.2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以|logFC| > 0.5，P < 0.05為過(guò)濾條件獲取差異基因，即RA相關(guān)基因。按照P值篩選前20個(gè)差異基因繪制基因熱圖。登錄在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//omim.org/）和Genecard（https：//www.genecards.org/），以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞檢索獲取RA相關(guān)基因。最終整理匯總獲取RA有效靶點(diǎn)。

1.2 四妙勇安湯有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）對(duì)四妙勇安湯中的金銀花、玄參、當(dāng)歸和甘草的有效成分及靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，以生物利用度（OB）> 30%，類藥性（DL） > 0.18為篩選條件，獲得4味中藥的有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。登錄蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot Database，https：//www.uniprot.org/）對(duì)所獲得的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲取的RA靶點(diǎn)基因與四妙勇安湯有效靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，預(yù)測(cè)中藥對(duì)RA有效的作用靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。利用Cytoscape中的Bisogenet插件進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通過(guò)CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以度中心性（DC） > 61，介數(shù)中心性（BC） >?600進(jìn)行過(guò)濾，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO和KEGG分析 通過(guò)R軟件中的Cluster Profiler[5]對(duì)四妙勇安湯和RA交集基因進(jìn)行基因本體論（GO）[生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）]分析，京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析，對(duì)P值進(jìn)行FDR矯正，設(shè)置閾值校正P < 0.05，使用R軟件進(jìn)行繪圖。通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG與核心基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)量多少設(shè)置每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小，做可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 RA對(duì)應(yīng)靶點(diǎn) 通過(guò)GEO芯片數(shù)據(jù)分析獲得對(duì)照組和RA差異基因，以|logFC| > 0.5，P < 0.05為過(guò)濾條件，共獲得238個(gè)差異基因。使用R軟件繪制熱圖，見(jiàn)圖1。OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RA靶點(diǎn)48個(gè)。Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RA靶點(diǎn)4157個(gè)。整理后共獲得4443個(gè)靶點(diǎn)基因，刪除重復(fù)基因83個(gè)，保留4360個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 四妙勇安湯有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn) 登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)依次檢索4味中藥，以O(shè)B > 30%，DL > 0.18為檢索條件獲取金銀花有效成分23個(gè)，玄參有效成分9個(gè)，當(dāng)歸有效成分2個(gè)，甘草有效成分92個(gè)，其中山柰酚、槲皮素為金銀花、甘草的共有成分，豆甾醇為金銀花、當(dāng)歸的共有成分，β-谷甾醇為金銀花、當(dāng)歸、玄參的共有成分，谷甾醇為玄參、甘草的共有成分，及其相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共2355個(gè)。登錄蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得的靶點(diǎn)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名，去除重復(fù)靶點(diǎn)和無(wú)法匹配的靶點(diǎn)，最后獲得2044個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及CytoNAC網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將獲取的RA相關(guān)靶點(diǎn)和四妙勇安湯靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲得四妙勇安湯治療RA的潛在基因165個(gè)。通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行四妙勇安湯調(diào)控RA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見(jiàn)圖2。

通過(guò)Cytoscape軟件中的Bisogenet插件，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)包括DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINI、BIND，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。使用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得7644個(gè)節(jié)點(diǎn)。以DC > 61過(guò)濾獲得1549個(gè)節(jié)點(diǎn);繼續(xù)以BC > 600依次過(guò)濾，最終獲得733個(gè)節(jié)點(diǎn)。依據(jù)BC值排名靠前的有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶1（NTRK1）、腫瘤蛋白質(zhì)P53（TP53）、Cullin 3（CUL3）、雌激素受體1（ESR1）、泛素C（UBC）、微染色體維護(hù)復(fù)合體組分（MCM2）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等。

2.4 GO分析 使用R軟件對(duì)四妙勇安湯和RA的交集基因進(jìn)行GO分析，包括BP、CC、MF，以校正P < 0.05為過(guò)濾條件，BP獲得通路2329個(gè)，CC獲得通路89個(gè)，MF獲得通路163個(gè)，篩選前20個(gè)做圖，見(jiàn)圖3。

2.5 KEGG通路分析 使用R軟件對(duì)四妙勇安湯與RA交集基因進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)置校正P < 0.05過(guò)濾條件，獲得通路160個(gè)。使用R軟件對(duì)富集程度較高的前20個(gè)通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖4。通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG與核心基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)量多少設(shè)置每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小，做可視化處理，見(jiàn)圖5。其中DC較高的基因有絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1，17個(gè)）、MAPK3（17個(gè)）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1，17個(gè)）、癌基因同源物A（RELA，15個(gè)）、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴(kuò)散激酶（CHUK，14個(gè)）、IκBκB（14個(gè)）、MAPK8（13個(gè)）、MAPK10（13個(gè)）、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（BAX，13個(gè)）、RAF1（12個(gè)）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白（NFκBIA，12個(gè)）等。

3 討 論

RA是一種自身免疫性炎性風(fēng)濕病，影響許多組織和器官，引起慢性滑膜炎癥，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、慢性殘疾和預(yù)期壽命縮短[6]。近年來(lái)，國(guó)際新型藥物腫瘤壞死因子（TNF）抑制劑、JAK通路抑制劑等的研發(fā)和投入臨床，雖取得了良好的療效，但是由于藥物使用的局限性（如腫瘤、感染等患者不宜使用）和使用后的不良反應(yīng)，RA的臨床治療方法仍需不斷探索。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA的病因包括正虛與邪實(shí)兩個(gè)方面，正虛是發(fā)病的根本原因，主要為營(yíng)衛(wèi)不和、氣血不足、脾胃虛弱、肝腎虧虛等內(nèi)在因素;邪實(shí)是發(fā)病的重要條件，多指風(fēng)、寒、濕、熱等六淫之邪[7]。RA急性期的炎癥反應(yīng)如紅腫熱痛、皮下結(jié)節(jié)、紅色皮疹、身熱、煩躁、口干、溲黃正是熱盛成毒，濕郁化濁，二邪交結(jié)，阻滯氣血所致。四妙勇安湯對(duì)于毒熱痹阻、灼傷血脈的病機(jī)具有極強(qiáng)的針對(duì)性，且該方免疫調(diào)節(jié)機(jī)制又為其用于治療RA提供了充分的理由[8]。

已有研究顯示，山柰酚是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎等多種治療作用[9]。由于其抗炎特性，可能被用于治療許多急慢性炎癥引起的疾病，包括椎間盤退變、結(jié)腸炎、絕經(jīng)后骨質(zhì)流失和急性肺損傷。此外，它對(duì)癌癥、肝損傷、肥胖和糖尿病均有益處，能抑制血管內(nèi)皮炎癥，保護(hù)腦神經(jīng)和心臟功能，并可能用于治療纖維增生性疾病，包括增生性瘢痕[10]。槲皮素是已知抗氧化活性的自由基清除和抗過(guò)敏特性的特點(diǎn)是刺激免疫系統(tǒng)，抗病毒活性，抑制組胺釋放，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并抑制白細(xì)胞介素（IL）-4的產(chǎn)生;改善Th1/Th2平衡，抑制抗原特異性免疫球蛋白E抗體形成;對(duì)脂氧合酶、嗜酸性粒細(xì)胞和過(guò)氧化物酶等有抑制作用，對(duì)炎癥介質(zhì)有抑制作用[11-12]。

β-谷甾醇具有抗氧化劑、促血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病、抗炎、抗癌和鎮(zhèn)痛等作用，且無(wú)明顯的不良反應(yīng)[13]。

在人類培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行的全基因組基因敲除篩選顯示，CUL3對(duì)細(xì)胞活力有重要意義[14]，這表明CUL3甚至在內(nèi)皮細(xì)胞的維持中也起著至關(guān)重要的作用。另一篇文獻(xiàn)中也提到，CUL3的E3泛素連接酶（CRL）可以參與廣泛的細(xì)胞內(nèi)事件和調(diào)控機(jī)制，包括受體交叉信號(hào)傳遞、基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控和細(xì)胞-細(xì)胞連接構(gòu)成[15]。雌激素受體1（ESR1）與骨質(zhì)疏松易感性有關(guān)[16-21]，這可能與RA后期導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨質(zhì)破環(huán)有關(guān)。通過(guò)抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7，可以阻止細(xì)胞周期的G1或G2期的細(xì)胞周期進(jìn)程，減緩細(xì)胞炎癥，增殖和多種慢性疾病的發(fā)生[22]。

GO和KEGG通路分析富集結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激過(guò)程與炎癥和炎癥反應(yīng)的聯(lián)系密切[23]。已有研究表明，TNF和IL-17等炎癥通路與RA發(fā)病密切相關(guān)[18-19]。RA急性期的炎癥反應(yīng)明顯，四妙勇安湯可能通過(guò)影響氧化應(yīng)激生物過(guò)程干預(yù)急性期的炎癥反應(yīng)，緩解癥狀。氧化還原反應(yīng)（ROS）分子還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和依賴氧化還原調(diào)控一系列生物活性，類如骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞（MDSCs），這些異源髓樣細(xì)胞受ROS控制，但它們也使用ROS實(shí)現(xiàn)抑制功能[24]。諸如慢性炎癥、感染和癌癥之類的病理狀況會(huì)誘導(dǎo)MDSCs，MDSCs由未成熟髓細(xì)胞的異質(zhì)群體組成[25-26]。流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路，有文獻(xiàn)表明，生理層流切變可以促進(jìn)細(xì)胞在流動(dòng)方向上的伸長(zhǎng)和定向，從而抑制增殖，刺激抗炎基因的表達(dá)并抑制炎性途徑的表達(dá)[27]?，F(xiàn)有臨床試驗(yàn)表明，TNF、IL-6，以及可能的粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子對(duì)RA的發(fā)病過(guò)程至關(guān)重要[28]。

綜上所述，四妙勇安湯可能是通過(guò)多種活性成分，如山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇等，調(diào)控RA相關(guān)基因CUL3、ESAR1、CDK，通過(guò)氧化應(yīng)激過(guò)程、ROS等生物過(guò)程，進(jìn)一步調(diào)控多種信號(hào)通路，如年齡-憤怒信號(hào)通路、前列腺癌、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF、IL-17信號(hào)、JAK-STAT信號(hào)傳送途徑等通路抑制炎癥反應(yīng)和干預(yù)免疫調(diào)節(jié)，綜合作用機(jī)體治療RA。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)四妙勇安湯治療RA的作用機(jī)制進(jìn)行探討，可為臨床應(yīng)用四妙勇安湯及其類方治療RA提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2021-02-25;修回日期：2021-03-28

作者單位：鄭州市第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

通信作者：李院魏 河南省鄭州市管城區(qū)南順城街136號(hào)，964564470@qq.com，（0371）66905254