干姜水煎液對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的改善作用研究

文建霞 趙艷玲

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）09-1070-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.08

摘 要 目的：探討干姜水煎液對(duì)阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的改善作用。方法：以大鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度干姜水煎液（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL，以生藥量計(jì)，下同）對(duì)其存活率的影響;采用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)低、中、高濃度干姜水煎液（0.125、0.25、0.5 mg/mL）對(duì)阿霉素（5 μmol/L）致H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，并對(duì)其相對(duì)細(xì)胞總數(shù)、相對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度、相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析;采用生物能量分析儀檢測(cè)干姜水煎液（0.5 mg/mL）對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷后線粒體呼吸功能相關(guān)指標(biāo)（耗氧率、細(xì)胞外酸化率、基線耗氧率、基線細(xì)胞外酸化率、應(yīng)激耗氧率和應(yīng)激細(xì)胞外酸化率）和能量代謝相關(guān)指標(biāo)（基礎(chǔ)呼吸水平、最大呼吸水平、ATP產(chǎn)生水平、H+質(zhì)子滲漏水平、備用呼吸能力和非線粒體呼吸水平）的影響。結(jié)果：經(jīng)0.125、0.25、0.5 mg/mL的干姜水煎液作用后，H9c2心肌細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01）或差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷后，經(jīng)0.125、0.25、0.5 mg/mL（或0.5 mg/mL）的干姜水煎液干預(yù)，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，呈規(guī)則纖維狀貼壁分布;相對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞熒光強(qiáng)度、耗氧率、細(xì)胞外酸化率、基線耗氧率、基線細(xì)胞外酸化率、應(yīng)激耗氧率、應(yīng)激細(xì)胞外酸化率、基礎(chǔ)呼吸水平、最大呼吸水平、ATP產(chǎn)生水平、備用呼吸能力和非線粒體呼吸水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度、H+質(zhì)子滲漏水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：干姜水煎液可通過(guò)提高H9c2心肌細(xì)胞線線粒體呼吸功能和能量代謝，進(jìn)而改善其粒體功能損傷。

關(guān)鍵詞 干姜水煎液;H9c2心肌細(xì)胞;線粒體功能損傷;呼吸功能;能量代謝

Study on Improvement Effects of Zingiber officinale Decoction on Mitochondrial Function Injury of Cardiomyocytes

WEN Jianxia，ZHAO Yanling（Dept. of Pharmacy， Fifth Medical Center of PLA General Hospital， Beijing 100039， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the improvement effects of Zingiber officinale decoction （ZOD） on doxorubicin （DOX）-induced mitochondrial function injury of H9c2 cardiomyocytes. METHODS： Taking H9c2 cardiomyocytes as research object， the effects of different concentrations of ZOD （0.125， 0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8 mg/mL， by crude drug， the same below） on its survival rate were investigated by CCK-8 assay. The effects of low， medium and high concentrations of ZOD （0.125， 0.25， 0.5 mg/mL） on the morphology of H9c2 cardiomyocytes after DOX （5 μmol/L） induced mitochondrial dysfunction were detected by high content living cell imaging system. The relative number of cells， the relative fluorescence intensity of living cells and the relative fluorescence intensity of dead cells were analyzed quantitatively. The effects of ZOD （0.5 mg/mL） on related indexes of mitochondrial respiratory function （oxygen consumption rate， extracellular acidification rate， baseline oxygen consumption rate， baseline extracellular acidification rate， stress oxygen consumption rate and stress extracellular acidification rate） and energy metabolism （basic respiration level， maximum respiration level， ATP production level， H+ proton leakage level， spare respiration level and non-mitochondrial respiration level） were detected by bioenergy analyzer. RESULTS： After treated with 0.125， 0.25， 0.5 mg/mL ZOD， the survival rate of H9c2 cardiomyocytes were increased significantly （P<0.01） or had no statistical significance （P>0.05）. After DOX induced mitochondrial dysfunction of H9c2 cardiomyocytes， pretreated with 0.125， 0.25， 0.5 mg/mL （or 0.5 mg/mL） ZOD， the morphology of H9c2 cardiomyocytes returned to normal and showed regular fibrous adherent distribution. The relative cell number， fluorescence intensity of living cells， oxygen consumption rate， extracellular acidification rate， baseline oxygen consumption rate， baseline extracellular acidification rate， stress oxygen consumption rate， stress extracellular acidification rate， basic respiration level， maximal respiration level， ATP production level， spare respiration level and non-mitochondrial respiration level were all significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while relative dead cell fluorescence intensity and H+ proton leakage level were significantly decreased （P<0.01）. CONCLUSIONS： ZOD can improve the respiratory function and mitochondrial energy metabolism of H9c2 cardiomyocytes， so as to improve mitochondrial function injury.

KEYWORDS? ?Zingiber officinale decoction; H9c2 cardiomyocytes; Mitochondrial function injury; Respiratory function; Energy metabolism

2019年《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告》推算，我國(guó)心血管疾病現(xiàn)患人數(shù)約3.3億，心力衰竭患者人數(shù)約890萬(wàn)，其中慢性心力衰竭患者約400萬(wàn)[1]。心力衰竭是各種心臟疾病的終末期，由于其較高的發(fā)病率和病死率，目前仍是嚴(yán)重危害人類健康的主要原因[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭最主要的致病因素為原發(fā)性心肌損害和異常[3]。其中，原發(fā)性心肌損害指各種類型的心肌病和心肌炎，包括擴(kuò)張型心肌病和病毒性心肌炎[4]、糖尿病心肌病[5]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性心肌病[6]等。其次，異常的心臟負(fù)荷如壓力負(fù)荷（后負(fù)荷）過(guò)重以及容量負(fù)荷（前負(fù)荷）過(guò)重也可引起心力衰竭[7-8]。此外，感染、心律失常、血容量增加以及藥物治療不當(dāng)?shù)纫彩钦T發(fā)心力衰竭的原因[3]。

心室肌重構(gòu)和神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂在心力衰竭發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]，心室肌代謝重構(gòu)包括線粒體功能的改變以及能量代謝底物利用的轉(zhuǎn)變[9]。線粒體為心肌細(xì)胞的能量加工廠，其能量代謝功能障礙是引起心力衰竭的重要原因[10-11]。因此，可通過(guò)藥物改善心肌細(xì)胞線粒體能量代謝功能，從而防治心力衰竭[12]。

天然藥物具有多成分、多靶點(diǎn)、多作用通路的特點(diǎn)，在心力衰竭的防治中發(fā)揮著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[13-14]。干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，味辛，性熱，具有溫中散寒、回陽(yáng)通脈的功效，是“熱”性中藥的典型代表之一[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，干姜提取物可顯著改善心力衰竭模型兔的心肌舒縮性，緩解其心力衰竭癥狀，保護(hù)心功能[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，干姜中活性化學(xué)成分姜辣素具有改善兔心血管功能的作用[17]。但干姜中活性成分是否可通過(guò)改善心肌細(xì)胞線粒體能量代謝功能來(lái)改善心功能，尚不明確。

基于此，本研究以干姜水煎液為研究對(duì)象，以阿霉素所致大鼠H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷模型為研究載體，檢測(cè)干姜水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)、呼吸功能和線粒體能量代謝的影響，來(lái)考察該水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的改善作用，以期為心力衰竭的新藥研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：HERAcell 150i型CO2普通培養(yǎng)箱、Cellomics Array Scan XT1 Infinity型高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Agilent Seahorse XFp型細(xì)胞能量代謝分析儀（美國(guó)Seahorse Bioscience公司），TD5A型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），DM 1L LED D-35578型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），TC10型細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國(guó)BioRad公司），SynergyH1型全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司），SXKW型數(shù)顯電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），R1002B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司），SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），Christ ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用干姜飲片購(gòu)自北京綠野藥業(yè)有限公司（批號(hào)17072001），經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部趙艷玲研究員鑒定為姜科植物姜Z. officinale Rosc.的干燥根莖。其他藥品與試劑有：鹽酸阿霉素（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB160921，純度≥98%），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)SH30022.01），F(xiàn)BS胎牛血清（以色列BI公司，批號(hào)04-001-1ACS），胰蛋白酶、青-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）、丙酮酸、谷氨酰胺[中科邁晨（北京）科技有限公司，批號(hào)分別為CC017、CC033、CC008、CC007、CC009]，二甲基亞砜（DMSO）、葡萄糖（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為D2650、G8769），細(xì)胞呼吸表型檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞線粒體壓力檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Seahorse Bioscience公司，批號(hào)分別為103275-100、9832913），Seahorse XF基礎(chǔ)培養(yǎng)基[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)13417002]，CCK-8試劑盒（美國(guó)Med Chem Express公司，批號(hào)HY-K0301），Hoechst 33342核酸染料、鈣黃綠素、溴乙啡錠二聚體1（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)分別為H3570、C3099、L3224）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格試劑，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用細(xì)胞為大鼠H9c2心肌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 干姜水煎液的制備

稱取干姜飲片100 g，以10倍量水（按mL/g計(jì)，下同）浸泡30 min，加熱回流提取1.5 h后，用雙層紗布過(guò)濾;濾渣加入8倍量水，再次回流提取1 h，過(guò)濾;合并2次濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于80 ℃、70 r/min、-0.06 MPa條件下濃縮后，于85 ℃水浴條件下蒸發(fā)得稠浸膏。浸膏于-80 ℃條件下冷凍后，置于冷凍干燥機(jī)中減壓干燥，制成凍干粉末（得率為23.05%，以生藥量計(jì)），備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代、接種或凍存。

2.3 H9c2心肌細(xì)胞存活率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]方法，采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，以培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞密度為8×104 mL-1的懸液，按100 μL/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和干姜水煎液不同濃度組[0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL，以生藥量計(jì)（下同），給藥質(zhì)量濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]，另設(shè)不加細(xì)胞的空白組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M、對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)基，干姜水煎液不同濃度組加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（OD給藥組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%]。

2.4 H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及定量分析

參考文獻(xiàn)[19-20]方法，采用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，按8 000個(gè)/孔接種于96孔板中，分為對(duì)照組、模型組和干姜水煎液低、中、高濃度組（0.125、0.25、0.5 mg/mL，給藥質(zhì)量濃度根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組和模型組細(xì)胞加入培養(yǎng)基100 μL，干姜水煎液各濃度組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸棄培養(yǎng)基;對(duì)照組再加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，模型組和干姜水煎液各濃度組均加入含5 μmol/L阿霉素的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄上清液，以PBS清洗2次后，每孔加入熒光染料混合液（由Hoechst 33342核酸染料、鈣黃綠素活細(xì)胞染料和溴乙啡錠二聚體1死細(xì)胞染料按50 ∶ 1 ∶ 7體積比配制而成）100 μL，避光靜置30 min后，吸棄染料混合液;以PBS清洗2次后，加入PBS適量，采用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)觀察各組細(xì)胞形態(tài)（藍(lán)色熒光表示所有細(xì)胞，綠色熒光表示活細(xì)胞，紅色熒光表示死細(xì)胞），并進(jìn)行定量分析。以對(duì)照組的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞熒光強(qiáng)度和死細(xì)胞熒光強(qiáng)度為參照，計(jì)算干姜水煎液不同濃度組和模型組細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞總數(shù)（相對(duì)細(xì)胞總數(shù)=給藥組或模型組細(xì)胞總數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞總數(shù)×100%）、相對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度（相對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度=給藥組或模型組活細(xì)胞熒光強(qiáng)度/對(duì)照組活細(xì)胞熒光強(qiáng)度×100%）和相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度（相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度=給藥組或模型組死細(xì)胞熒光強(qiáng)度/對(duì)照組死細(xì)胞熒光強(qiáng)度×100%）。

2.5 H9c2心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[21]方法和細(xì)胞呼吸表型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的相關(guān)方法，采用細(xì)胞能量代謝分析儀檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，按6 000個(gè)/孔接種于Seahorse XFp細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、模型組和干姜水煎液0.5 mg/mL組（給藥質(zhì)量濃度根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組和模型組中加入培養(yǎng)基80 μL，干姜水煎液0.5 mg/mL組加入含相應(yīng)藥液的培養(yǎng)基80 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，吸棄培養(yǎng)基;對(duì)照組再加入新鮮培養(yǎng)基80 μL，模型組加入含5 μmol/L阿霉素的培養(yǎng)基80 μL，干姜水煎液0.5 mg/mL組加入含5 μmol/L阿霉素和0.5 mg/mL干姜水煎液的培養(yǎng)基80 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入Seahorse XF基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗3～4次后，每孔均加入Seahorse XF基礎(chǔ)培養(yǎng)基180 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，采用細(xì)胞能量代謝分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞在藥物干預(yù)后0～50 min內(nèi)的耗氧率、細(xì)胞外酸化率，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書相關(guān)方法計(jì)算基線耗氧率、基線細(xì)胞外酸化率、應(yīng)激耗氧率和應(yīng)激細(xì)胞外酸化率。

2.6 H9c2心肌細(xì)胞中線粒體能量代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[22]方法和細(xì)胞線粒體壓力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的相關(guān)方法，采用細(xì)胞能量代謝分析儀進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下“按6 000個(gè)/孔接種……繼續(xù)培養(yǎng)1 h后”方法操作后，采用細(xì)胞線粒體壓力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞在藥物干預(yù)后0～80 min內(nèi)的耗氧率，并計(jì)算細(xì)胞耗氧率、基礎(chǔ)呼吸水平、最大呼吸水平、ATP產(chǎn)生水平、H+質(zhì)子滲漏水平、備用呼吸能力、非線粒體呼吸水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 干姜水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，干姜水煎液0.125 mg/mL組細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01），干姜水煎液1、2、4、8 mg/mL組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），干姜水煎液0.25、0.5 mg/mL組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖1?；诖耍罄m(xù)選擇0.125、0.25、0.5 mg/mL的干姜水煎液研究其對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。

3.2 干姜水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，呈規(guī)則的纖維狀，且貼壁分布均勻;模型組細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞死亡并懸浮于培養(yǎng)基中;干姜水煎液0.125、0.25、0.5 mg/mL組的細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，呈規(guī)則的纖維狀貼壁分布，詳見圖2。

與對(duì)照組比較，模型組相對(duì)細(xì)胞總數(shù)、相對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著降低（P<0.01），相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，干姜水煎液各濃度組相對(duì)細(xì)胞總數(shù)、相對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著升高（P<0.05或P<0.01），相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著降低（P<0.01），詳見圖3。

3.3 干姜水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞線粒體中耗氧率（0～50 min）、細(xì)胞外酸化率（0～50 min）、基線耗氧率、基線細(xì)胞外酸化率、應(yīng)激耗氧率、應(yīng)激細(xì)胞外酸化率均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，干姜水煎液0.5 mg/mL組細(xì)胞上述呼吸功能指標(biāo)均顯著升高（P<0.01），詳見圖4。

3.4 干姜水煎液對(duì)心肌細(xì)胞線粒體能量代謝的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞耗氧率、基礎(chǔ)呼吸水平、最大呼吸水平、ATP產(chǎn)生水平、H+質(zhì)子滲漏水平、備用呼吸能力、非線粒體呼吸水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，干姜水煎液0.5 mg/mL組細(xì)胞耗氧率、基礎(chǔ)呼吸水平、最大呼吸水平、ATP產(chǎn)生水平、備用呼吸能力、非線粒體呼吸水平均顯著升高（P<0.01），H+質(zhì)子滲漏水平顯著降低（P<0.01），詳見圖5。

4 討論

阿霉素是治療不同類型腫瘤最廣泛使用的廣譜化療藥物之一，并且能不可逆轉(zhuǎn)地抑制線粒體功能，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體能量代謝紊亂[22]。因此，本研究采用阿霉素建立心肌細(xì)胞損傷模型。為了直觀體現(xiàn)干姜水煎液對(duì)阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的改善作用，本研究對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的增殖、形態(tài)進(jìn)行了定性和定量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.125 mg/mL干姜水煎液作用后，H9c2心肌細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01），經(jīng)0.25、0.5 mg/mL的干姜水煎液作用后，其細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此選擇這3個(gè)質(zhì)量濃度研究干姜水煎液對(duì)阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的改善作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.125、0.25、0.5 mg/mL的干姜水煎液干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，成規(guī)則纖維狀貼壁分布，相對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著升高，相對(duì)死細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著降低，表明干姜水煎液對(duì)H9c2心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

ATP的產(chǎn)生在維持心肌細(xì)胞能量供應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，藥物對(duì)心肌細(xì)胞ATP生成的影響與線粒體能量代謝功能相關(guān)聯(lián)[23]。心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能和能量代謝可用于反映藥物對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，為了解藥物引起細(xì)胞線粒體功能障礙的原因和深入理解心肌細(xì)胞能量表型、代謝途徑和細(xì)胞信號(hào)提供了視角。其中，耗氧率用于衡量細(xì)胞線粒體呼吸速率，反映細(xì)胞的氧化磷酸化水平;細(xì)胞外酸化率用于衡量細(xì)胞糖酵解速率;基礎(chǔ)呼吸水平為剛開始分析時(shí)細(xì)胞的呼吸水平;最大呼吸水平為加入應(yīng)激源化合物后誘導(dǎo)能量需求下細(xì)胞的呼吸水平，以上指標(biāo)可為探討藥物對(duì)細(xì)胞氧化磷酸化和糖酵解途徑的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[24]。另外，H+質(zhì)子滲漏水平是線粒體功能損傷的標(biāo)志，其水平降低預(yù)示著線粒體ATP合成升高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，干姜水煎液可升高線粒體功能損傷H9c2心肌細(xì)胞的耗氧率、細(xì)胞外酸化率，提高心肌細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸水平，降低H+質(zhì)子滲漏水平，促進(jìn)心肌細(xì)胞ATP生成;由此說(shuō)明干姜水煎液可通過(guò)提高H9c2心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能和能量代謝功能，發(fā)揮改善H9c2心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的作用。

綜上所述，干姜水煎液可通過(guò)提高H9c2心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能和能量代謝，改善其線粒體功能損傷。后續(xù)本課題組將在動(dòng)物水平開展相關(guān)研究來(lái)評(píng)價(jià)干姜水煎液對(duì)心力衰竭模型動(dòng)物的干預(yù)作用及機(jī)制，以期為其在預(yù)防和治療心力衰竭中的應(yīng)用提供參考。

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（收稿日期：2020-12-10 修回日期：2021-02-05）

（編輯：唐曉蓮）