癸源煎配方顆粒對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降模型小鼠的改善作用及機(jī)制研究

王月嬌 孫兆貴 徐蓮薇 郁琳 張瑜 劉小菲 李盛楠 叢超 趙莉

中圖分類號(hào) R271.9;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）09-1051-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.05

摘 要 目的：研究癸源煎配方顆粒（GDFG）對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）模型小鼠的改善作用及機(jī)制。方法：將動(dòng)情周期正常的42只雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇組（陽性對(duì)照，0.15 mg/kg）和GDFG低、中、高劑量組（0.75、1.49、2.98? ? ? ?g/kg），每組7只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠均腹腔注射順鉑（3 mg/kg）復(fù)制DOR模型。造模成功后，給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，模型組和對(duì)照組小鼠灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定小鼠血清中抗米勒管激素（AMH）和促卵泡生成素（FSH）水平;采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠卵巢組織病理學(xué)形態(tài);采用免疫組化法觀察小鼠卵巢組織中AMHR受體Ⅱ（AMHRⅡ）、Smad4蛋白的分布情況;采用Western blot法檢測小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），血清中FSH水平顯著升高（P<0.01）;卵泡組織中可見卵泡皺縮、卵泡核丟失、卵巢間質(zhì)纖維化、黃體疏松; AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡膜上和卵巢間質(zhì)中。與模型組比較，GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），血清中FSH水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;卵巢組織中可見各級(jí)卵泡、卵泡形態(tài)改善，未見明顯核丟失和卵丘形成;AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細(xì)胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布。結(jié)論：GDFG可改善DOR模型小鼠的卵巢功能，其機(jī)制可能與升高血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平，改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞膜和卵泡核內(nèi)的分布以及降低血清中FSH水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 卵巢儲(chǔ)備功能下降;癸源煎配方顆粒;抗米勒管激素;促卵泡生成素;抗米勒管激素Ⅱ受體;Smad4;小鼠

Study on Improvement Effects and Its Mechanism of Guiyuan Decoction Formula Granules on Model Mice with Decreased Ovarian Reserve

WANG Yuejiao1，2，SUN Zhaogui3，XU Lianwei2，YU Lin3，ZHANG Yu3，LIU Xiaofei1，LI Shengnan2，CONG Chao1，ZHAO Li1（1. Dept. of Gynaecology， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 200032， China; 2. Longhua Clinical Medical College， Shanghai University of TCM， Shanghai 200032， China; 3.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and its mechanism of Guiyuan decoction formula granules （GDFG） on model mice with decreased ovarian reserve （DOR）. METHODS： Totally 42 female ICR mice whith with normal estrous cycle were randomly divided into control group， model group， estradiol valerate group （positive control， 0.15 mg/kg） and GDFG low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.75， 1.49， 2.98 g/kg）， with 7 mice in each group. Except for control group， other groups were given cisplatin （3 mg/kg） intraperitoneally to establish DOR model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically; model group and control group were given normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After last administration， ELISA assay was used to measure the serum levels of anti-Müllerian hormone （AMH） and follicle-stimulating hormone （FSH） in mice. Histopathological morphology of ovarian was observed by HE staining. Protein distribution of AMH receptor Ⅱ（AMHRⅡ） and Smad4 in ovarian tissue were observed by immunohistochemistry. Protein expression of AMHRⅡ and Smad4 were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with control group， the serum level of AMH， the expression of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue in model group were significantly decreased （P<0.01）， while the FSH level in serum was significantly increased （P<0.01）; follicles were crumpled and lost nucleus， ovarian interstitial were fibrosis， luteum were loose; AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue were mainly distributed in the follicle membrane and ovarian interstitial. Compared with model group， the serum level of AMH， the expression of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue was increased significantly in GDFG groups （P<0.01）， while the serum level of FSH was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; in ovarian tissue， follicles at all levels could be found and follicle morphology was improved， and no obvious nuclear loss and cumulus formation were found; AMHRⅡ and Smad4 protein were mainly distributed in the follicular nucleus （except for GDFG high-dose group） and the granular cell membrane （mainly distributed in the sinus follicles of GDFG medium-dose group）; they were slightly distributed around the mature follicular nucleus or in corpus luteum. CONCLUSIONS： GDFG can improve ovarian function of DOR model mice. The mechanism may be related with promoting serum level of AMH， protein expression of AMHRⅡ and Smad4， improving the distribution of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian granulosa cell membrane and follicular nucleus， reducing FSH levels.

KEYWORDS? ?Decreased ovarian reserve; Guiyuan decoction formula granules;Anti-Müllerian hormone; Follicle stimulating hormone; Anti-Müllerian hormone receptor; Smad4; Mice

卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR），是指卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的數(shù)量減少和（或）質(zhì)量下降，同時(shí)伴有抗米勒管激素（AMH）水平降低、竇卵泡數(shù)減少、促卵泡生成素（FSH）水平升高、患者生育能力下降[1]。DOR臨床表現(xiàn)有月經(jīng)后期（即月經(jīng)周期延后7天及以上）、經(jīng)量減少等，其進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)月經(jīng)頻發(fā)或月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)，甚至卵巢早衰、生育能力喪失[2]。DOR的病因尚不明確，目前普遍認(rèn)為其是由多因素所致，如基因損傷、染色體異常、自身免疫損傷、手術(shù)損傷、放化療、感染等;另外，環(huán)境變化、生活習(xí)慣或嗜好不良，亦可促進(jìn)DOR的發(fā)生發(fā)展[3-8]。

目前，西醫(yī)臨床對(duì)DOR并無特效治療方法，一般以調(diào)節(jié)生活方式、干預(yù)心理狀態(tài)、激素補(bǔ)充等治療為主[9]。DOR屬于中醫(yī)婦科學(xué)“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”等疾病范疇，中醫(yī)治療多以滋腎填精、調(diào)理沖任、濡養(yǎng)胞宮等為主[10-11]。癸源煎處方是由明代醫(yī)學(xué)大家張介賓的《景岳全書》[12]中“地黃醴”一方加味而成，由熟地黃、枸杞子、肉蓯蓉、仙靈脾、菟絲子、雞血藤、香附等7味藥物組成，現(xiàn)已被上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院院開發(fā)成院內(nèi)制劑“癸源煎配方顆?！保ㄒ韵潞唽憺椤癎DFG”）。經(jīng)本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，該配方顆粒對(duì)于DOR患者有較好的改善癥狀，可保護(hù)患者的卵巢功能[13]。目前，本課題組也正在進(jìn)行GDFG的多中心、大樣本的臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，以期為其上市奠定基礎(chǔ)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞異常增殖或凋亡、卵泡發(fā)育不良、優(yōu)勢卵泡形成減少，可導(dǎo)致DOR[14-15]。其中，卵泡的發(fā)育主要經(jīng)歷募集、選擇、成熟等生物過程，其募集與選擇過程受AMH、FSH調(diào)控：AMH一方面可防止2～8 mm的小竇卵泡過度增長，并降低竇卵泡對(duì)FSH的敏感性，從而促進(jìn)優(yōu)勢卵泡的選擇，進(jìn)而有效防止卵泡池耗竭、調(diào)控卵泡生長[16];另一方面，AMH可與AMH受體Ⅱ（AMHRⅡ）結(jié)合，然后經(jīng)過信號(hào)傳導(dǎo)與公共蛋白Smad4相結(jié)合，從而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控卵巢功能相關(guān)基因的表達(dá)[17]。然而，GDFG是否可通過AMH/Smad信號(hào)通路改善DOR的作用機(jī)制尚不明確，基于此，本研究采用腹腔注射順鉑以復(fù)制DOR模型小鼠，通過不同劑量GDFG干預(yù)后，檢測小鼠血清中AMH、FSH的水平，觀察其卵巢組織形態(tài)和卵泡發(fā)育情況，并檢測其卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布和表達(dá)水平，以探討GDFG改善卵巢儲(chǔ)備功能的機(jī)制，以期為中醫(yī)藥防治DOR提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Multizoom AZ100型光學(xué)生物顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]、GH-200型萬分之一電子天平（日本A&D公司）、Centrifuge5804R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、RM2125RTS型石蠟切片機(jī)（瑞士Lecia公司）、TissueRuptor Ⅱ型手持式勻漿器（德國Qiagen公司）、Tanno 5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)FA4A8106A，規(guī)格10 mg），GDFG（四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司），戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)J20171038，規(guī)格1 mg），血清AMH、FSH酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海欲鵬生物科技有限公司，批號(hào)分別為LA374189、LF374103），兔源AMHRⅡ單克隆抗體、兔源Smad4單克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為PB1037、PB0446、A00227-1、AR1191），生物素高效標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）多克隆抗體（二抗）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、山羊血清、RIPA裂解液、BSA溶液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為A0279、C0221A、C0265、P0013C、ST025、P0012S、P0202），TBST緩沖液（美國Sigma公司，批號(hào)91414-10TAB），生理鹽水（上海百特醫(yī)療用品有限公司，批號(hào)H19994067）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)ICR小鼠，雌性，8周齡，體質(zhì)量為25～30 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度為24 ℃、濕度為60%、晝夜光照節(jié)律為12 h。飼養(yǎng)期間飼料及飲用水充足，動(dòng)物可自由飲食、進(jìn)水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 天后，根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]方法對(duì)小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，篩選出動(dòng)情周期正常的小鼠共42只，然后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇組（陽性對(duì)照，0.15 mg/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和GDFG低、中、高劑量組（0.75、1.49、2.98 g/kg，劑量分別為臨床等效劑量的0.5、1、2倍），每組7只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠均腹腔注射順鉑（3 mg/kg，以生理鹽水溶解）復(fù)制DOR模型。造模期間各組小鼠每天上午9時(shí)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查：當(dāng)其陰道上皮細(xì)胞、角化細(xì)胞明顯減少，白細(xì)胞明顯增多時(shí)，表明造模成功。造模成功后，GDFG各劑量組和戊酸雌二醇組小鼠每日上午9時(shí)灌胃相應(yīng)藥液0.3 mL（臨用時(shí)以生理鹽水溶解），對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

2.2 小鼠血清中AMH、FSH水平的檢測

采用ELISA法進(jìn)行檢測。末次給藥后，各組小鼠通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血。血樣于室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書相關(guān)方法操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定血清中AMH、FSH的水平。

2.3 小鼠卵巢組織的病理學(xué)形態(tài)觀察

各組小鼠采血后，處死，取其左側(cè)卵巢組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)70%、80%、90%、95%乙醇和無水乙醇梯度脫水，再以二甲苯透明替換、浸蠟、包埋、切片（厚度約5 μm），平行制備6片。將石蠟切片以二甲苯分次脫蠟，于無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇中逐級(jí)浸泡，然后以水沖洗。各小鼠取2片切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色（另外4片后續(xù)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)），然后于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織的病理學(xué)形態(tài)。

2.4 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布情況檢測

采用免疫組化法進(jìn)行檢測。取“2.3”項(xiàng)下各小鼠另外4片切片，經(jīng)脫蠟并復(fù)水后，以PBS沖洗5 min×3次，滴加3%H2O2室溫靜置10 min;以PBS沖洗5 min×3次，置于枸緣酸鈉溶液中煮沸10 min以熱修復(fù)抗原;冷卻后以PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清進(jìn)行封閉，室溫靜置20 min;甩去多余液體，滴加AMHRⅡ、Smad4一抗（稀釋度均為1 ∶ 500 ）50 ?L，室溫靜置1 h;以PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000）50 ?L，室溫靜置1 h;以PBS沖洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色10 min后，以PBS沖洗10 min后脫水封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。當(dāng)切片中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒則為陽性表達(dá)，出現(xiàn)不著色或淺色則為陰性表達(dá)。

2.5 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.3”項(xiàng)下各組小鼠右側(cè)卵巢組織，剪碎，按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入RIPA裂解液，于勻漿機(jī)中研磨，直至裂解液中組織塊消失。充分裂解后，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜70 min，以5% BSA溶液室溫封閉2 h;以TBST洗膜5 min×3次，加入AMHRⅡ、Smad4、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 500），孵育過夜;以TBST洗膜5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），孵育1 h;以TBST洗膜5 min×3次，經(jīng)ECL顯色后，置于凝膠成像儀中曝光成像。采用Image J 1.8.0軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以AMHRⅡ、Smad4與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值表示相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性采用單因素方差分析;若方差不齊，以Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清中AMH、FSH水平的測定結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中AMH水平顯著降低，F(xiàn)SH水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平均顯著升高（P<0.01），F(xiàn)SH水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 小鼠卵巢組織病理學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)照組小鼠卵巢組織中可見各級(jí)卵泡，竇卵泡、排卵前卵泡形態(tài)正常，卵泡液充盈，黃體致密，血管規(guī)則;與對(duì)照組比較，模型組小鼠卵巢組織中可見卵泡皺縮、卵泡核丟失、卵巢間質(zhì)纖維化、黃體疏松、卵泡液減少，出現(xiàn)閉鎖卵泡;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中可見各級(jí)卵泡、卵泡形態(tài)改善，未見明顯核丟失和卵丘形成，詳見圖1。

3.3 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布情況

對(duì)照組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵巢顆粒細(xì)胞膜上及卵泡核內(nèi)，卵泡膜及黃體上亦有分布;模型組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡膜及卵巢間質(zhì);戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細(xì)胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布，詳見圖2。

3.4 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），詳見圖3、表2。

4 討論

AMH是反映女性卵巢儲(chǔ)備功能、評(píng)估女性生殖能力的重要指標(biāo)：AMH由巢內(nèi)竇前卵泡和小竇卵泡的卵巢顆粒細(xì)胞分泌，通過其自分泌及旁分泌作用，抑制原始卵泡募集、減少竇前卵泡和小竇卵泡對(duì)FSH的依賴性生長，促進(jìn)優(yōu)勢卵泡選擇，對(duì)于卵泡發(fā)育成熟有重要的調(diào)節(jié)作用;AMH分泌減少可導(dǎo)致原始卵泡的募集增加、小竇卵泡對(duì)FSH的敏感性增強(qiáng)、卵泡過度生長，加速卵泡儲(chǔ)備池耗竭[16]。AMH主要有AMHRⅠ、AMHRⅡ兩類受體，AMHRⅡ主要分布在卵巢顆粒細(xì)胞膜上，可與AMH直接結(jié)合，通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白樣激酶磷酸化后與AMHRⅠ形成異聚體復(fù)合物，再通過與Smad1/5/8受體蛋白結(jié)合并激活公共受體Smad4，從而發(fā)揮調(diào)控發(fā)育的作用[21-22]。但是，當(dāng)AMHRⅡ蛋白分布于成熟卵泡和間質(zhì)上時(shí)，與AMH結(jié)合后，將不能與Smad4結(jié)合，從而不發(fā)揮調(diào)控發(fā)育的作用[23-24]。

GDFG是我院婦科用于治療DOR的常用制劑，經(jīng)臨床研究也發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)患者月經(jīng)周期、恢復(fù)生殖軸、改善卵巢功能，但其作用機(jī)制尚不明確[13]?；诖?，本研究建立了DOR小鼠模型，以探討GDFG改善DOR的潛在作用機(jī)制。

順鉑為鉑類化合物，是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，具有生殖毒性[18-19]，故本研究通過對(duì)8周齡ICR小鼠一次性腹腔注射順鉑以復(fù)制DOR模型，造模成功后，以臨床常用雌激素戊酸雌二醇為陽性對(duì)照，進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中AMH水平顯著降低，F(xiàn)SH水平顯著升高;卵巢組織出現(xiàn)閉鎖卵泡，卵泡形態(tài)皺縮、核丟失、卵泡液減少，且AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核及卵巢間質(zhì)，其蛋白表達(dá)水平顯著降低。經(jīng)藥物連續(xù)干預(yù)4周后發(fā)現(xiàn)，GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平均顯著升高，F(xiàn)SH水平均顯著降低;卵巢組織中卵泡形態(tài)改善、未見明顯核丟失和卵丘形成，且AMHRⅡ、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著升高。GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細(xì)胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布。由此說明，GDFG可通過改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞膜及卵泡核內(nèi)的分布，減弱AMHRⅡ、Smad4蛋白分布于卵巢間質(zhì)的傾向，從而促進(jìn)AMH/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而降低血清中FSH水平。

綜上所述，GDFG可改善DOR模型小鼠的卵巢功能，其機(jī)制可能與升高血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4表達(dá)水平，改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞膜及卵泡核內(nèi)的分布，降低血清中FSH水平有關(guān)。后續(xù)本課題組將研究GDFG干預(yù)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞AMH/Smads 信號(hào)通路的具體環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)，以期觀察該制劑對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步闡釋GDFG調(diào)節(jié)卵泡募集、保護(hù)卵巢儲(chǔ)備功能的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2020-12-21 修回日期：2021-03-11）

（編輯：唐曉蓮）