16 個(gè)產(chǎn)地紅曲中洛伐他汀及桔霉素測(cè)定

齊方圓任 丹黃紫妍秦路平*朱 波*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310053； 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712046）

紅曲是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，用藥歷史悠久，是藥食兩用中藥的代表藥之一［1］。紅曲是以稻米為原料，由曲霉科真菌紫色紅曲霉Monascus purpureusWent發(fā)酵而成，臨床上用于治療高脂血癥、降低膽固醇，其主要活性成分洛伐他汀，可作為膽固醇合成途徑中3?羥基?3?甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG?CoA）還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，有效減少膽固醇的合成［2?4］。純天然發(fā)酵的紅曲產(chǎn)品中，洛伐他汀是以內(nèi)酯式與酸式2 種形式存在［1］，內(nèi)酯式洛伐他汀需體內(nèi)產(chǎn)生的羥基酯酶水解成酸式方能發(fā)揮藥效，酸式洛伐他汀與HMG?CoA 還原酶結(jié)構(gòu)更為接近，具有更強(qiáng)的生物活性［5］。2020 年版《中國(guó)藥典》中關(guān)于紅曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了內(nèi)酯式洛伐他?。–24H36O5）不得少于0.22%，且有的研究也僅測(cè)定了紅曲中內(nèi)酯式洛伐他汀的含量［6?8］，忽略了酸式洛伐他汀的存在，因此同時(shí)測(cè)定紅曲中2 種構(gòu)型洛伐他汀的含量更能反映紅曲產(chǎn)品的質(zhì)量。此外，紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的真菌毒素桔霉素［9］，具有肝腎毒性［10］、致畸性［11］與致癌性［3，12?13］，是危及人類、動(dòng)物健康的潛在威脅，在一定程度上限制了紅曲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前關(guān)于同時(shí)測(cè)定紅曲中內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀與桔霉素的研究鮮有報(bào)道，已有報(bào)道也僅針對(duì)少數(shù)產(chǎn)地［14］，并不能客觀地反映現(xiàn)有市場(chǎng)上紅曲產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣及安全性。綜上，本實(shí)驗(yàn)收集全國(guó)紅曲主產(chǎn)區(qū)16 個(gè)產(chǎn)地紅曲樣品，以內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素3 種成分為指標(biāo)性狀，建立HPLC?PDA／FLR 法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，并分析比較其含量差異，以期為紅曲藥材的質(zhì)量控制與安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Waters Alliance e2695 型高效液相色譜儀（配置自動(dòng)進(jìn)樣器、柱恒溫箱、PDA 及FLR 雙檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司）；KQ?300DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2204B 型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；免疫親和柱（CitriTestTMHPLC，北京中檢維康技術(shù)有限公司）。洛伐他?。˙20806）、桔霉素（B25912）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；PBS 緩沖液（上海生工生物工程有限公司）。樣品信息見(jiàn)表1。乙腈（色譜純，美國(guó)天地公司）；磷酸（色譜純，上海阿拉丁公司），其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 洛伐他汀，ZORBAX Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫（1～5 min，60%～65% A；5～20 min，65% A；20～25 min，65%～90%A；25～30 min，90%～60% A；30～35 min，60%A）；柱溫28 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；進(jìn)樣量10 μL。桔霉素，ZORBAX Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?水（磷酸調(diào)pH2.5）（53.5 ∶46.5）；柱溫28 ℃；體積流量1.0 mL／min；熒光檢測(cè)器（λex＝331 nm，λem＝500 nm）；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取洛伐他汀對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成206.4 μg／mL 對(duì)照品溶液。精密稱取內(nèi)酯式洛伐他汀對(duì)照品2 mg，適量甲醇溶解，用0.2 mol／L NaOH溶液超聲轉(zhuǎn)化40 min，取出冷卻后，用3 mol／L磷酸將pH 調(diào)至7.7，甲醇定容至10 mL 量瓶，即得208.9 μg／mL 對(duì)照品溶液［14］。精密稱取桔霉素對(duì)照品1 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，質(zhì)量濃度為100 μg／mL，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將各?duì)照品溶液用甲醇進(jìn)行稀釋后，在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，見(jiàn)表2，可知各指標(biāo)成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。各對(duì)照品溶液稀釋至不同倍數(shù)后，在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，采用信噪比法測(cè)定各指標(biāo)成分的檢測(cè)限（S／N ＝3 ∶1）、定量限（S／N ＝10 ∶1），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

1.2.3 樣品含量測(cè)定

1.2.3.1 洛伐他汀測(cè)定供試品溶液制備 精密稱取經(jīng)充分粉碎均質(zhì)紅曲粉末（紅曲米、膠囊及片劑均研磨粉碎后過(guò)5 號(hào)篩）0.5 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz）45 min 后取出，放冷，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，離心（4 000 r／min）10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3.2 桔霉素供試品溶液制備 精密稱取均質(zhì)紅曲粉末（紅曲米、膠囊及片劑均研磨粉碎后過(guò)5號(hào)篩）1.0 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇提取液，搖晃均勻，60 ℃恒溫提取30 min，每10 min 搖動(dòng)30 s。移取1.0 mL 經(jīng)槽紋濾紙過(guò)濾后的濾液，39 mL PBS 溶液稀釋、混勻，微纖維濾紙過(guò)濾，收集濾液。精密吸取該濾液10 mL，以1～2 滴／s 體積流量全部通過(guò)CitriTestTMHPLC 親和柱直至空氣流通。再加入10 mL 0.1%吐溫?20 PBS 溶液（1～2 滴／s）流經(jīng)親合柱，最后加入1.0 mL 甲醇?0.1%磷酸（70 ∶30）洗脫液以1 滴／s或者更低的體積流量淋洗CitriTestTMHPLC 親和柱，收集所有樣品淋洗液（1.0 mL）于干凈容器中，備用。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取質(zhì)量濃度為20.02、10.45 μg／mL 的內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀對(duì)照品溶液各10 μL，以及100 ng／mL 桔霉素對(duì)照品溶液20 μL，在“1.2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素保留時(shí)間RSD 分別為0.11%、0.19%、0.96%，峰面積 RSD 分別為 1.59%、1.38%、1.80%，表明儀器精密度良好。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取浙江SM 樣品0.5 g、福建TX 樣品1.0 g，按“1.2.3”項(xiàng)下方法分別平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素峰面積RSD 分別為1.26%、1.45%、1.63%，含量RSD 分別為1.22%、1.40%、1.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取浙江SM 樣品0.5 g、福建TX 樣品1.0 g，按“1.2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h后在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素峰面積RSD 分別為1.56%、1.26%、1.41%，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取含量已知的杭州TJT紅曲樣品6 份，每份精密稱定0.5 g，分別加入等量的內(nèi)酯式洛伐他汀對(duì)照品溶液（0.806 5 mg）和酸式洛伐他汀對(duì)照品溶液（0.864 5 mg），取含量已知的福建TX 紅曲樣品6 份，每份精密稱定1.0 g，分別加入等量的桔霉素對(duì)照品溶液（3.122 μg），按“1.2.3”項(xiàng)下方法分別制備測(cè)定洛伐他汀及桔霉素供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)，方差分析采用單因素ANOVA，聚類分析采用組間聯(lián)接法［15］。

2 結(jié)果

2.1 洛伐他汀含量比較 16 個(gè)產(chǎn)地間紅曲中洛伐他汀含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見(jiàn)表4，內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、總洛伐他汀平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.790、1.464、8.254 mg／g。2020年版《中國(guó)藥典》 紅曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，含內(nèi)酯式洛伐他汀不得少于0.22%，本實(shí)驗(yàn)16 批樣品中7個(gè)產(chǎn)地（浙江建德、浙江寧波、浙江江山、山東濱州、成都高新、北京中關(guān)村和北京懷柔）符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中浙江寧波產(chǎn)最高，達(dá)（32.611±0.047）mg／g；其他產(chǎn)地（如浙江杭州、浙江麗水、福建古田、福建南平、福建南平、湖北武漢、云南昆明、臺(tái)灣嘉義）樣品以內(nèi)酯式洛伐他汀含量計(jì)，不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n＝3）

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n＝3）

注：**P＜0.01。

2.2 桔霉素含量比較 16 個(gè)產(chǎn)地間紅曲中桔霉素含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見(jiàn)表4，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.895 μg／g。關(guān)于桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)相關(guān)規(guī)定有所不同，如《中國(guó)藥典》 紅曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下無(wú)桔霉素，而由國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)與國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局共同發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.222?2016）［16］中規(guī)定，桔霉素定量限為80 μg／kg。表4 顯示，本實(shí)驗(yàn)16 批樣品中部分產(chǎn)地（如浙江建德、浙江麗水、浙江杭州，福建南平、成都高新）均未檢測(cè)出桔霉素，安全性相對(duì)較好，而大多數(shù)產(chǎn)品，尤其是福建屏南所產(chǎn)紅曲桔霉素含量最高，達(dá)（21.854±0.176）μg／g，不符合上述標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 聚類分析 以內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀和總洛伐他汀含量為參考指標(biāo)，對(duì)各批樣品進(jìn)行聚類分析，根據(jù)歐氏距離D2＝13.12 將不同產(chǎn)地劃分為4 個(gè)類群，見(jiàn)圖2。類群Ⅰ共10 個(gè)產(chǎn)地，分別為云南昆明、臺(tái)灣嘉義、福建古田1、福建南平、福建屏南、福建古田2、湖北武漢、浙江杭州、北京懷柔、浙江麗水，該類群內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀與總洛伐他汀含量均較低；類群Ⅱ共2 個(gè)產(chǎn)地，分別為山東濱州、北京中關(guān)村，該類群內(nèi)酯式洛伐他汀與總洛伐他汀含量較高，但酸式洛伐他汀含量較低；類群Ⅲ為2 個(gè)產(chǎn)地，分別為浙江建德、成都高新，該類群內(nèi)酯式洛伐他汀與總洛伐他汀含量均較高，酸式洛伐他汀含量在所有產(chǎn)地中偏高；類群Ⅳ中2 個(gè)產(chǎn)地分別為浙江寧波、浙江江山，兩者內(nèi)酯式洛伐他汀、總洛伐他汀含量在所有產(chǎn)地中偏高，酸式洛伐他汀含量較高。

圖2 16 批樣品聚類樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrogram of sixteen batches of samples

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用PDA 檢測(cè)器對(duì)內(nèi)酯式及酸式洛伐他汀對(duì)照品溶液在210～400 nm 波長(zhǎng)范圍下進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為238.2 nm。測(cè)定洛伐他汀考察了流動(dòng)相（甲醇?水、乙腈?水、甲醇?0.1%磷酸、乙腈?0.1% 磷酸）、提取溶劑（75% 乙醇、甲醇、乙腈）、超聲時(shí)間（30、45、60 min）對(duì)紅曲中洛伐他汀含量的影響，發(fā)現(xiàn)在乙腈?0.1%磷酸系統(tǒng)下基線相對(duì)平穩(wěn)，峰形相對(duì)尖銳，各峰之間分離度良好，甲醇與乙腈的提取效果相對(duì)75% 乙醇較好，但兩者之間無(wú)明顯差別，超聲45 min 即可提取完全，故選擇以乙腈?0.1%磷酸為流動(dòng)相，甲醇提取超聲45 min。測(cè)定桔霉素考察了流動(dòng)相乙腈?水（磷酸調(diào)pH 2.5）比例（60 ∶40、53.5 ∶46.5、50 ∶50、40 ∶60）對(duì)桔霉素色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)在比例53.5 ∶46.5 條件下，桔霉素保留時(shí)間為8.036 min 適宜，與溶劑峰之間能夠較好地分離，各峰之間分離度良好。

目前，常用的桔霉素檢測(cè)方法主要有HPLC法、酶聯(lián)免疫吸附法和高效毛細(xì)管電泳法等，這些方法均需復(fù)雜的樣品前處理步驟，過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，且難以進(jìn)行痕量檢測(cè)［17］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和柱處理的方法直接對(duì)紅曲中的桔霉素進(jìn)行富集凈化，利用柱內(nèi)桔霉素的高度特異性抗體吸附，快速特異地將桔霉素從樣品中分離出來(lái)，并同時(shí)完成凈化和濃縮步驟，速度快，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)16 個(gè)產(chǎn)地紅曲產(chǎn)品質(zhì)量存在差異，以浙江產(chǎn)紅曲質(zhì)量較好，而其他產(chǎn)地如福建、云南、臺(tái)灣等地所產(chǎn)紅曲質(zhì)量次之，這可能是由于各產(chǎn)地紅曲菌種、制備條件以及生產(chǎn)加工方式差別而造成的。下一步將利用同一菌種以同一制備條件和生產(chǎn)加工方式在不同產(chǎn)地環(huán)境下制備紅曲，比較其有效成分含量差異，探索不同產(chǎn)地環(huán)境下穩(wěn)定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)紅曲的制備工藝，以期為紅曲產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供依據(jù)。