當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制作用機(jī)制的分析

羅伊揚(yáng) 江婷 丁詩意 王彬彬*

化療相關(guān)性骨髓抑制是化療的常見不良反應(yīng)之一，可以表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少、貧血和血小板減少，且可以導(dǎo)致感染、出血等并發(fā)癥，從而增加發(fā)病率和死亡率［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸多糖和黃芪多糖能夠激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［2］，當(dāng)歸補(bǔ)血湯的載藥血清能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和GMCSF、IL-3的分泌，增加骨髓有核細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2和促細(xì)胞增殖基因cmyc mRNA表達(dá)［3］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是英國藥理學(xué)家Hopkins于2007年提出的概念，是一門新興的藥理學(xué)分支學(xué)科，其在構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”多層次結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上多分子藥物協(xié)同治療疾病的作用機(jī)制，與中醫(yī)的整體觀念相吻合。本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯的主要活性成分、治療化療相關(guān)性骨髓抑制的潛在靶點(diǎn)以及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分及靶基因的收集與篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一個建立在中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)基礎(chǔ)上的數(shù)據(jù)庫及分析平臺。本實(shí)驗(yàn)通過TCMSP平臺，以“黃芪”“當(dāng)歸”作為關(guān)鍵詞檢索，選擇“Ingredients”，再通過設(shè)置口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18作為篩選條件，得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯的關(guān)鍵活性成分。再選擇“Related Targets”，篩選后獲得當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分所相對應(yīng)的靶基因，并通過uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶基因的查找 GeneCards （https：//www.genecards.org/）是一個關(guān)于人類基因注釋性信息的全面、權(quán)威的匯編。OMIM （https：//omim.org/）是根據(jù)已出版的生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)每天更新的一個人類基因和表型的知識庫。本實(shí)驗(yàn)通過GeneCards及OMIM疾病數(shù)據(jù)庫檢索化療相關(guān)性骨髓抑制的相關(guān)靶基因。

1.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制靶基因預(yù)測 將當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分相對應(yīng)靶基因與化療相關(guān)性骨髓抑制靶基因進(jìn)行成分映射，得到藥物-疾病共同靶基因，這些靶基因可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制的關(guān)鍵靶基因，并記錄共同靶基因所對應(yīng)的當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分。

1.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將當(dāng)歸補(bǔ)血湯的活性成分，當(dāng)歸補(bǔ)血湯與化療相關(guān)性骨髓抑制的關(guān)鍵靶基因以及屬性關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)可視化處理。在網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)（node）表示關(guān)鍵活性成分以及關(guān)鍵靶基因，邊（edge）表示各個節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 登錄STRING （Version 11.0，https：//string-db.org/），選擇“multiple proteins”，輸入當(dāng)歸補(bǔ)血湯與化療相關(guān)性骨髓抑制的共同靶基因，選擇研究物種為“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，選擇中等置信度（0.400），得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選出排名前30的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.6 GO富集分析以及KEGG通路富集分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫將藥物-疾病共同靶基因轉(zhuǎn)換成entrezID。在R軟件（Version 3.6.2）安裝Bioconductor相關(guān)安裝包，設(shè)置pvalue<0.05，qvalue<0.05進(jìn)行藥物-疾病共同靶基因的GO富集分析以及KEGG通路富集分析，輸出結(jié)果并繪制柱狀圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分和靶基因 TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到當(dāng)歸補(bǔ)血湯共有212個活性成分，其中黃芪活性成分87個，當(dāng)歸活性成分125個，經(jīng)OB>30%及DL>0.18篩選后，分別剩余20個黃芪和2個當(dāng)歸活性成分，見表1。再選擇“Related Targets”，篩選后獲得當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分所相對應(yīng)的靶基因。其中，黃芪中共得到360個靶基因，當(dāng)歸中得到52個靶基因，刪除重復(fù)項(xiàng)后，剩余141個靶基因，其中有33個靶基因?yàn)辄S芪和當(dāng)歸所共有。

2.2 藥物-疾病靶基因預(yù)測 共得到46個共同靶基因，視為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制的可能的關(guān)鍵靶基因。同時，記錄共同靶基因所對應(yīng)的當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分，最終得到關(guān)鍵活性成分8個，分別為Jaranol（熊竹素），hederagenin（常春藤皂苷元），isorhamnetin（異鼠李素），3，9-Di-O-methylnissolin，Bifendate（聯(lián)苯雙酯），formononetin（芒柄花黃素），kaempferol（山奈酚），Quercetin（槲皮素）。見圖1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分及其OB與DL值

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分靶基因與化療相關(guān)性骨髓抑制靶基因取交集后的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 此網(wǎng)絡(luò)共包含56個節(jié)點(diǎn)，100條邊。通過網(wǎng)絡(luò)圖觀察到多種成分作用于同一個靶點(diǎn)或一種成分作用于多個靶點(diǎn)，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制具有多成分、多靶點(diǎn)以及多作用途徑的特點(diǎn)。使用CentiScape2.2計算活性成分的度中心性（DC），DC是網(wǎng)絡(luò)分析中的一個重要指標(biāo)，一個節(jié)點(diǎn)的DC越大，表明該節(jié)點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。Quercetin（槲皮素）為28，kaempferol（山奈酚）為11，isorhamnetin（異鼠李素）為4，位于前3位。見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將關(guān)鍵靶基因?qū)氲絊TRING平臺，選擇研究物種為“Homo sapiens”，選擇中等置信度（0.400），得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含46個節(jié)點(diǎn)，411條邊。通過R語言計算每個基因的連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，從而得到前30個核心基因，見圖4。其中，AKT1、IL-6、VEGFA、CXCL8以及IL1B位于前5位。

圖2 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（紅色-化療相關(guān)性骨髓抑制，黃色-當(dāng)歸補(bǔ)血湯，紫色-當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分，綠色-關(guān)鍵靶基因）

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI核心基因

2.5 GO功能富集分析 當(dāng)歸補(bǔ)血湯主要參與細(xì)胞因子活性，細(xì)胞因子受體結(jié)合，受體配體活性，生長因子受體結(jié)合，蛋白磷酸酶結(jié)合，作用于NAD（P）H、以血紅蛋白為受體的氧化還原酶活性，磷酸酶結(jié)合，血紅素結(jié)合，四吡咯結(jié)合，生長因子活性，抗氧化活性，單加氧酶活性，作用于成對供體、摻入或合并氧分子、以NAD（P）H為一個供體并摻入一個氧原子的氧化還原酶活性，核受體活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性等。見圖5。

2.6 KEGG通路富集分析 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制的信號通路主要包括流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，恰加斯病通路，HIF-1信號通路，人巨細(xì)胞病毒感染通路，IL-17信號通路，TNF信號通路，JAK-STAT信號通路，鉑類藥物耐藥通路，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路等。見圖6。

圖5 關(guān)鍵靶基因GO功能富集

圖6 關(guān)鍵靶基因KEGG通路富集

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)并無“骨髓抑制”這一病名，通過患者乏力納差、心悸短氣、頭暈?zāi)垦！⒕氲∽院沟劝Y狀推斷出化療相關(guān)性骨髓抑制的主要病機(jī)是氣血不足［8］。而化療藥物性情剛猛，為有毒之物，易損傷臟腑。中醫(yī)學(xué)氣血生化理論認(rèn)為，腎為先天之本，藏精之處，主骨生髓；脾為后天之本，氣血生化之源，故脾腎兩臟與氣血生化密切相關(guān)，治療化療相關(guān)性骨髓抑制時多從這兩臟入手。

本研究最終得到22個當(dāng)歸補(bǔ)血湯的活性成分，預(yù)測出槲皮素，山奈酚，異鼠李素可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制的關(guān)鍵成分。已有研究表明，槲皮素?zé)o論在體內(nèi)還是體外都可以顯著降低依托泊苷對DNA的氧化損傷，同時也能顯著減少由依托泊苷引起的骨髓前體細(xì)胞和紅系有核細(xì)胞的減少［4］，另外，閔珺［5］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1/NF-kB信號通路并抑制自由氧釋放來抵抗TNF-α誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡，而BMSCs與造血干細(xì)胞關(guān)系密切，不僅對其有機(jī)械支持作用還能分泌IL-6，IL-11等生長因子促進(jìn)造血。山奈酚對小型豬肝微粒體系統(tǒng)中的羥基自由基具有顯著保護(hù)作用，從而可以減輕阿霉素導(dǎo)致的骨髓抑制［6］。山奈酚也可以通過下調(diào)ROS/Fox O信號通路抑制氧化反應(yīng)導(dǎo)致的BMSCs凋亡現(xiàn)象［7］。異鼠李素可以抑制RANKL誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞中的MAPK、NF-κB和AKT信號通路的活化［8］。

通過關(guān)鍵靶基因的PPI蛋白互作分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因，其中AKT1、IL-6、VEGFA、CXCL8以及IL1B位于核心位置。AKT1基因?qū)Χ喾N細(xì)胞功能至關(guān)重要，在PI3K/Akt1信號通路中占據(jù)重要地位，是維持長期造血干細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子［9］。IL-6具有顯著造血調(diào)控作用，其具有促進(jìn)造血干細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，促進(jìn)髓系前體細(xì)胞增殖分化以及促進(jìn)晚期紅系造血等功能［10］，已有研究表明IL-6可以顯著提高化療后小鼠外周血中血小板及中性粒細(xì)胞的數(shù)量［11］。VEGFA是VEGF家族中最主要的因子，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對內(nèi)皮和造血干細(xì)胞的表達(dá)至關(guān)重要［12］，而VEGF可通過自分泌環(huán)控制造血干細(xì)胞的存活和再增殖而調(diào)節(jié)造血功能［13］。CXCL8對中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞具有趨化作用，并能促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞以及多能造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血［14］。IL1B在穩(wěn)態(tài)造血和緊急造血中發(fā)揮重要作用，其可以通過誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生和分泌，繼而誘導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子的產(chǎn)生和分泌促進(jìn)造血干細(xì)胞和髓細(xì)胞的增殖［15］，其次，也可以通過驅(qū)動產(chǎn)生IL-6來進(jìn)行造血調(diào)控。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制關(guān)鍵靶基因的生物學(xué)過程富集分析表明，靶基因關(guān)聯(lián)的生物學(xué)過程主要涉及細(xì)胞因子活性，細(xì)胞因子受體結(jié)合，受體配體活性，生長因子受體結(jié)合，蛋白磷酸酶結(jié)合等。這些生物學(xué)過程都在關(guān)鍵靶基因和具體通路過程中得到體現(xiàn)。骨髓是一個天然的低氧腔室，HIF-1信號通路介導(dǎo)造血干細(xì)胞對低氧的反應(yīng)，可以通過調(diào)控Notch受體、VEGFA以及CXCR4保障造血干細(xì)胞的存活、調(diào)控造血干細(xì)胞的更新和分化［16］。IL-17信號通路與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤患者血清中的IL-17表達(dá)水平高于正常人［17］，化療會誘導(dǎo)IL-17快速而顯著侵襲［18］，而IL-17過高表達(dá)則會抑制造血功能，故當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過作用于此信號通路，降低外周血中IL-17等炎性因子的表達(dá)，減少造血干細(xì)胞的破壞及骨髓微環(huán)境的失衡，從而發(fā)揮治療作用的。此外，當(dāng)歸補(bǔ)血湯還通過細(xì)胞凋亡通路、MAPK信號通路等多個與造血功能相關(guān)的通路以及免疫相關(guān)信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療相關(guān)性骨髓抑制體現(xiàn)中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)以及多作用途徑的特點(diǎn)，為后續(xù)進(jìn)一步探究提供一定參考。