Box-Behnken響應面法結合差示分光光度法優(yōu)化瓜蔞中總黃酮提取工藝

胡 倩，錢婉智，鄒純才，鄢海燕

（皖南醫(yī)學院藥學院，安徽 蕪湖241002）

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或 雙 邊 栝 樓（Trichosan?thesros?thorniiHarms）的成熟果實，其果皮和種子即瓜蔞皮和瓜蔞子［1］皆可入藥。由于瓜蔞不易保存，臨床及科研工作中常以不同比例的瓜蔞皮和瓜蔞子代替瓜蔞入藥［2］。黃酮類化合物是一種天然藥理活性成分，具有抗胃潰瘍等作用［3，4］，它通過抑制胃酸過度分泌，降低胃蛋白酶活性，抑制胃潰瘍的產生，促進潰瘍的愈合來發(fā)揮抗胃潰瘍的作用［5］。有研究表明瓜蔞具有抗胃潰瘍作用［6，7］，瓜蔞中黃酮類化合物成分可能是瓜蔞抗胃潰瘍作用的有效成分［8］。瓜蔞皮與瓜蔞子的比例、提取溶劑、提取時間與提取溫度等因素都可能影響瓜蔞中總黃酮的提取率，同時在對瓜蔞中總黃酮含量測定時，需采用差示分光光度法消除干擾因素對總黃酮含量測定的影響。因此本實驗采用Box-Behnken響應面法結合差示分光光度法優(yōu)化瓜蔞中總黃酮的提取工藝，為瓜蔞中總黃酮的提取及后續(xù)瓜蔞抗胃潰瘍研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

UV 1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；AUW-220D型電子天平（日本島津公司）；Hei?dolph-LR4010/4011旋轉蒸發(fā)儀（德國海道爾夫公司）；瓜蔞皮（河北安國市御顏坊中藥材有限公司，批號：20171202）；瓜蔞子（河北安國市御顏坊中藥材有限公司，批號：20200420）；蘆?。ǔ啥计辗频律锛夹g有限公司，純度≥95%，批號：151023）；三氯化鋁（山東西亞化學工業(yè)有限公司，批號：20150604）；無水乙酸鈉（上海展云化工有限公司，批號：191010）；冰醋酸（天津市福晨化學試劑廠，批號：20160802）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 0.1 mol/L三氯化鋁溶液 精密稱取三氯化鋁1.333 6 g，置于100 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得。

1.2.1.2 1 mol/L醋酸溶液 精密量取58.8 mL的冰醋酸至1 L的量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得。

1.2.1.3 醋酸鈉-醋酸緩沖液（p H=5.62） 取無水乙酸鈉10.0 g精密稱定，用20 mL的1 mol/L醋酸溶液溶解，加蒸餾水稀釋至50 mL，即得。

1.2.1.4 蘆丁對照品溶液 取0.01 g蘆丁，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得0.2 mg/mL的蘆丁對照品儲備液；精密量取蘆丁對照品儲備液7.5 mL置于10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得濃度為150μg/mL的蘆丁對照品稀釋液。

1.2.1.5 樣品溶液的制備 取20 g瓜蔞皮和30 g瓜蔞子（在40℃烘箱中烘干），精密稱定，按照料液比1∶10（g/mL）［9］加入70%乙醇溶液，常溫下浸泡30 min，置于超聲清洗機（功率200 W，40 Hz）于40℃超聲提取3次，每次60 min，合并濾液，4℃下靜置12 h，過濾，取濾液；用旋轉蒸發(fā)儀減壓回收溶劑得浸膏，浸膏用20 mL的蒸餾水洗至分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層并回收溶劑。殘渣用無水乙醇溶解并定容至5 mL的量瓶中，備用。

1.2.2 總黃酮含量測定方法的建立

1.2.2.1 檢測波長的確定 取適量的蘆丁對照品溶液和樣品溶液，分別以無水乙醇為參比，掃描蘆丁對照品溶液和樣品溶液顯色前的光譜圖；取適量的蘆丁對照品溶液和樣品溶液，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液和醋酸鈉-醋酸緩沖液（V∶V∶V=1∶2∶1，全文同），室溫顯色30 min，以同法處理的無水乙醇、0.1 mol/L三氯化鋁溶液和醋酸鈉-醋酸緩沖液為參比，掃描蘆丁對照品溶液和樣品溶液顯色后的光譜圖。比較蘆丁對照品溶液和樣品溶液顯色前、后的光譜圖，確定樣品的檢測波長。

1.2.2.2 標準曲線的建立 精密量取蘆丁對照品稀釋液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL分別置于10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，配備成濃度為0.75、1.5、3、6、12、24μg/mL的儲備液，以無水乙醇為參比，在421 nm測定吸光度，記為A1；精密量取蘆丁對照品稀釋液（150μg/mL）0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL分別置于10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液，無水乙醇定容至刻度，室溫顯色30 min［10］，以無水乙醇、三氯化鋁溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液為參比，在421 nm處測定吸光度A2；計算相同濃度蘆丁組顯色前后的吸光度差值ΔA(ΔA=A2-A1)。

1.2.3 方法學驗證

1.2.3.1 精密度試驗 精密量取150μg/mL的蘆丁對照品稀釋液0.2 mL于10 mL的量瓶中，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，平行測定5次，記錄ΔA值。

1.2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取0.2 mL同一樣品溶液于10 mL的量瓶中，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，分別于0、15、30、45、60、75 min測定，記錄ΔA值。

1.2.3.3 重復性試驗 取同一批瓜蔞藥材（批號：20171202、20200420），按“1.2.1.5”項下方法制備樣品5份，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，記錄ΔA值。

1.2.3.4 回收率試驗 取已知總黃酮含量的樣品溶液9份，分別精密量取適量的蘆丁對照品溶液置于樣品溶液中（蘆丁質量分別為所取樣品溶液中總黃酮質量的80%、100%和120%，各3份），按“1.2.2.2”項下方法進行處理，平行測定3次，記錄ΔA值，計算樣品加樣回收率。

1.2.4 單因素考察 在相關文獻和預實驗的基礎上［11-13］，以瓜蔞皮和瓜蔞子的比例（以下簡稱皮子比例）、乙醇濃度、提取時間、提取溫度為考察因素，皮子比例設為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7，乙醇濃度設為50%、60%、70%、80%、90%，提取時間設為30、45、60、75、90 min，提取溫度設為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。以樣品顯色前后的吸光度差值ΔA為評價指標，判斷各單因素中最優(yōu)條件，為下一步響應面優(yōu)化提供依據。

1.2.4.1 皮子比例的影響 按照“1.2.1.5”項下的方法，設置皮子比例7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7進行超聲提取，制備5批樣品溶液，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.2 乙醇濃度的影響 按照“1.2.1.5”項下的方法，皮子比例定為5：5、設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%進行超聲提取，制備5批樣品溶液，按“1.2.2.2”項下的方法進行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.3 提取時間的影響 按照“1.2.1.5”項下的方法，皮子比例定為5∶5，乙醇濃度定為80%，設置時間為30、45、60、75、90 min進行超聲提取，制備樣品溶液，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.4 溫度的影響 按照“1.2.1.5”項下的方法，皮子比例定為5∶5，乙醇濃度定為80%，提取時間定為60 min，設置溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進行超聲提取，制備樣品溶液，按“1.2.2.2”項下方法進行處理，記錄ΔA值。

1.2.5 Box?Behnken響應面法優(yōu)化設計工藝［14-16］

試驗設計：在單因素試驗的基礎上，選擇皮子比例（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）及提取溫度（D）為考察因素，以平行測定三次結果的平均值ΔA（Y）為指標，采用4因素3水平的Box-Behnken設計優(yōu)化瓜蔞中總黃酮的提取工藝。

2 結果

2.1 檢測波長的確定

通過掃描蘆丁對照品和樣品溶液在250～750 nm處的紫外-可見光譜圖，發(fā)現蘆丁對照品和樣品溶液顯色后均在421 nm處存在最大吸收峰，但是樣品顯色前在421 nm波長也有吸收，因此不能采用紫外-可見分光光度法直接測定樣品顯色后的吸光度來計算總黃酮的含量。為了提高總黃酮含量測定的準確性，排除干擾物質的影響［17，18］，可采用差示分光光度法于421 nm波長處測定瓜蔞中的總黃酮含量，見圖1。

圖1 蘆丁對照品和樣品顯色前后的光譜圖及差示光譜圖Fig 1 Spectr ogram and differ ential spectr ogram of r utin reference substance and sample befor e and after color ation

2.2 標準曲線的確定

按“1.2.2.2”項下方法，以ΔA為縱坐標，蘆丁對照品稀釋液的濃度（μg/mL）為橫坐標建立標準曲線，回歸方程為ΔA=0.036 2C-0.024，r=0.9992，結果表明蘆丁在0.75～24μg/mL的范圍內線性關系良好。

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度 按“1.2.3.1”項下方法，精密度試驗RSD值為1.38%，表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性 按“1.2.3.2”項下方法，穩(wěn)定性試驗RSD值為0.33%，表明樣品在顯色后75 min內穩(wěn)定。

2.3.3 重復性 按“1.2.3.3”項下方法，重復性試驗RSD值為1.65%，表明方法重復性良好。

2.3.4 回收率 按“1.2.3.4”項下方法，平均回收率結果為95.1%，加樣回收率試驗RSD值為2.09%，表明方法準確度較好。

2.4 單因素考察

按“1.2.4”項下方法確定皮子比例、乙醇濃度、提取時間、提取溫度對瓜蔞中總黃酮含量的影響。由圖2可知，ΔA會隨著瓜蔞子所占比例的增加而先增大后減小，當皮子比例為5∶5時，ΔA值最大。由圖3可知，ΔA會隨著乙醇濃度的增大而先增大后減小，當乙醇濃度為80%時，ΔA值最大。由圖4可知，ΔA會隨著提取時間的延長而先增大后減小，當提取時間為60 min時，ΔA值最大。由圖5可知，ΔA會隨著提取溫度的升高而先增大后減小，當提取溫度為50℃時，ΔA值最大。

圖2 不同皮子比例的ΔA值（n=3）Fig 2 ΔA value of different proportions of Trichosanthis per icar pium and Trichosanthis semen（n=3）

2.5 響應面優(yōu)化

圖3 不同乙醇濃度的ΔA值（n=3）Fig 3 ΔA values of different ethanol concentrations（n=3）

圖4 不同提取時間的ΔA值（n=3）Fig 4 ΔA values at different extraction time points（n=3）

圖5 不同提取溫度的ΔA值（n=3）Fig 5 ΔA values at different extraction temperatures（n=3）

2.5.1 Box?Behnken試驗結果與方差分析 試驗各因素和水平設計見表1。通過響應面優(yōu)化設計，共需進行29組試驗，結果見表2，對29組試驗的ΔA進行分析，結果如表3所示。模型F=7.21，P<0.001，說明實驗采用的二次多項式回歸方程模型是顯著的；失擬項P=0.787 1>0.05，無顯著性差異，說明此回歸模型擬合程度較好，因此可通過這個模型來反映瓜蔞中總黃酮的提取工藝中各因素與響應值之間的關系。

回歸方程為：Y=0.29-3.083×10-4A-0.041B+8.992C×10-3-0.015D+0.011AB+6.588×10-3AC-0.022AD+0.028BC+0.018BD-0.016CD-0.030A2-0.038 B2-0.039C2-4.360×10-3D。

表1 Box-Behnken響應面優(yōu)化法實驗因素與水平Tab 1 Experimental factors and levels of Box-Behnken re?sponse surface method

表2 Box-Behnken試驗安排及結果Tab 2 Testarrangementand results of Box-Behnken re?sponse surface method

表3 響應面回歸模型各項方差分析Tab 3 Analysis of variance in response surface regression models

2.5.2 響應面分析與優(yōu)化 使用Design-Ex?pert8.0.6軟件，選擇對各指標有顯著影響的2個因素，做出相應的曲面圖，見圖6。

圖6反映的是皮子比例、乙醇濃度、提取時間、提取溫度對ΔA的影響。從三維效應圖中可知各影響因素間的交互作用對響應值的影響，曲面越陡，說明影響越大。從圖6Ⅰ～Ⅲ可知ΔA值隨著乙醇濃度的增加先增大后減小，由圖6Ⅱ、Ⅳ可知ΔA隨提取溫度的升高而降低。

圖6 各因素對響應值影響的三維效應曲面圖Fig 6 Three-dimensional effect surface diagrams of the influence of various factors on response values

2.5.3 優(yōu)選工藝的預測與驗證 采用Design-Ex?pert8.0.6軟件對提取工藝進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化工藝條件為A=4∶6，B=74.5%，C=63.15 min，D=40℃。根據實驗的實際操作情況，確定最佳工藝條件為A=4∶6，B=70%，C=60 min，D=40℃，即選擇皮子比例為4∶6，乙醇濃度為70%，提取時間60 min，提取溫度40℃。根據該工藝條件，經三次驗證試驗，ΔA平均值為0.308，RSD＝0.65%，模型的預測結果ΔA為0.309。結果顯示實際測定結果與模型預測結果差值為?0.001，表明優(yōu)化后的提取工藝可行。

3 討論

現有文獻報道［10］，以三氯化鋁為顯色劑，采用紫外可見分光光度法來直接測定提取物中總黃酮的含量較為方便快捷。但現有文獻多未考慮在所選擇的測定波長處非黃酮類物質的干擾吸收，影響了測定結果的準確性。在本實驗過程中發(fā)現，瓜蔞總黃酮提取物樣品以三氯化鋁顯色前、后，在所選擇的421 nm波長處均有吸收，若采用三氯化鋁顯色后于421 nm波長處直接測定總黃酮含量，將使測得的總黃酮含量偏高，影響測定結果的準確性。差示分光光度法的數學原理簡單，易于接受，同時由于該方法既保留了通常的分光光度法簡單、快速、直接讀數的優(yōu)點，又能消除干擾，從而受到廣大藥物分析工作者的青睞。為此，鑒于瓜蔞提取物在三氯化鋁顯色前后表現出各自不同的光譜特征，本文采用差示分光光度法消除了非黃酮類物質的干擾吸收，準確測定了瓜蔞提取物中總黃酮的含量。

影響顯色法定量分析結果準確度的因素較多。因此，采用三氯化鋁顯色法測定瓜蔞中總黃酮含量時，要注意控制顯色時間，降低人為因素造成的吸光度波動。在本文的單因素考察和Box-Behnken響應面法優(yōu)化設計工藝中，均設置了平行試驗（n=3），考察了實驗數據精密度對結果的影響，提高了實驗數據的可靠性。

本實驗在單因素考察的基礎上采用Box-Behnken設計優(yōu)化了瓜蔞中黃酮的提取工藝，確定最佳工藝條件為瓜蔞皮和瓜蔞子的比例為4∶6、乙醇濃度為70%、超聲提取時間為60 min和超聲提取溫度為40℃。

作者貢獻度說明：

胡倩：撰寫論文，承擔了所有實驗內容，錢婉智：協助藥材的提取，鄒純才、鄢海燕：指導實驗設計和結果分析。