基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的四妙勇安湯治療深靜脈血栓形成機(jī)制研究

劉 湘，張 玥，公茂旺，劉效敏，趙亞男

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周圍血管病科，山東 濟(jì)南250014；3.泰安市中醫(yī)二院，山東 泰安271000；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)損傷骨科，山東 濟(jì)南250014）

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是以肢體突發(fā)粗腫、脹痛為臨床表現(xiàn)的靜脈回流障礙性疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DVT屬于“股腫”“脈痹”“瘀血流注”等范疇。瘀熱互結(jié)之病機(jī)始終存在于DVT的病變過(guò)程中，因此清熱解毒、涼血散瘀為首要治法［1］。四妙勇安湯是治療熱毒熾盛之脫疽的經(jīng)典名方，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草4味中藥組成，因其具有的清熱解毒、活血通絡(luò)之功效契合瘀熱互結(jié)之病機(jī)而被常用于治療包括DVT在內(nèi)的各種周圍血管疾病，并取得了顯著療效［2?4］。但是四妙勇安湯治療DVT的機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)對(duì)藥物與疾病進(jìn)行分析且融合多項(xiàng)學(xué)科的新興學(xué)科，具有整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)［5］。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，整合分析數(shù)據(jù)庫(kù)中藥物與疾病的信息，構(gòu)建藥物?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)，以探究四妙勇安湯治療DVT的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯有效成分篩選

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取四妙勇安湯中金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的有效成分，按照口服生物利 用 度（oral bioavail?ability，OB）≥30，類 藥 性（drug?likeness，DL）≥0.18的條件對(duì)有效成分進(jìn)行篩選。

1.2 有效成分作用靶點(diǎn)獲取

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘有效成分的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將作用靶點(diǎn)的名稱作標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 DVT靶點(diǎn)的獲取

在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以“deep venous thrombosis”為關(guān)鍵詞檢索DVT的相關(guān)靶點(diǎn)，并以“inference score≥30”為條件對(duì)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

1.4 蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)EXCEL將有效成分作用靶點(diǎn)與DVT靶點(diǎn)取交集，去除重復(fù)值后得到四妙勇安湯治療DVT的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.5 構(gòu)建藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（Node）分別代表中藥、成分、靶點(diǎn)與疾病，節(jié)點(diǎn)之間通過(guò)邊（Edge）來(lái)連接。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）的大小篩選出網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)。

1.6 四妙勇安湯治療DVT通路富集分析

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2中CluoGO v2.5.5插件GO Biological Process來(lái)分析四妙勇安湯有效成分治療DVT靶點(diǎn)生物過(guò)程，運(yùn)用KEGG以“P<0.01”對(duì)獲取的治療DVT的通路進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分篩選

根據(jù)篩選條件，在TCMSP中篩選出金銀花有效成分23個(gè)，玄參有效成分9個(gè)，當(dāng)歸有效成分2個(gè)，甘草有效成分93個(gè)。除去重復(fù)的有效成分后，共得到四妙勇安湯121個(gè)有效成分。

2.2 有效成分作用靶點(diǎn)

獲取金銀花有效成分作用靶點(diǎn)122個(gè)，玄參55個(gè)，當(dāng)歸64個(gè)，甘草125個(gè)。將靶點(diǎn)合并去除重復(fù)值后，共獲得137個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.3 DVT相關(guān)靶點(diǎn)

從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以“deep venous thrombosis”為關(guān)鍵詞、以“inference score≥30”為條件篩選獲取與DVT相關(guān)靶點(diǎn)1 172個(gè)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

經(jīng)過(guò)取交集并去除重復(fù)值后，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)80個(gè)，并繪制維恩圖，見圖1。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入四妙勇安湯治療DVT的關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，以及靶點(diǎn)之間的關(guān)系，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點(diǎn)80個(gè)，邊925條，平均度值為23.13。度值越高表示該節(jié)點(diǎn)所代表的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越高。將相互連接的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IL6、TP53、EGF、VEGFA、JUN、TNF、EGFR、MAPK1、ESR1等靶點(diǎn)度值較高，作用較為重要。

2.5 藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖1 四妙勇安湯有效成分作用靶點(diǎn)與DVT相關(guān)靶點(diǎn)交集Fig 1 Intersection of the effect targets of active compo?nents of Simiao Yong'an Decoction and DVT?re?lated targets

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)由193個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，其中4個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、108個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、80個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和1個(gè)疾病靶點(diǎn)，六邊形代表疾病節(jié)點(diǎn)，橢圓形代表中藥節(jié)點(diǎn)，菱形代表成分節(jié)點(diǎn)，矩形代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的Degree值越大，說(shuō)明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。根據(jù)Degree值大小篩選出核心成分和靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、β?谷甾醇（beta?sitosterol）、山奈酚（kaempferol）等有效成分以及雌激素受體1（es?trogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（androgen re?ceptor，AR）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/h synthetase 2，PTGS2）等靶點(diǎn)是該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，表明這些節(jié)點(diǎn)是四妙勇安湯治療DVT的重要成分或靶點(diǎn)，見表1。

表1 四妙勇安湯治療DVT的核心節(jié)點(diǎn)Tab 1 Core nodes of Simiao Yong'an Decoction in the treat?ment of DVT

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of key targets

2.6 藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病通路分析

通過(guò)ClueGO將四妙勇安湯治療DVT的生物過(guò)程和通路進(jìn)行分析，運(yùn)用GO Biological Process并選擇P<0.01的生物過(guò)程，共214條，關(guān)鍵靶點(diǎn)富集顯著的前5條生物過(guò)程，為對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（33個(gè)靶點(diǎn)），細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)（29個(gè)靶點(diǎn)），對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（29個(gè)靶點(diǎn)），細(xì)胞遷移的正調(diào)控（28個(gè)靶點(diǎn)），氧化應(yīng)激反應(yīng)（27個(gè)靶點(diǎn)），見表2。證明四妙勇安湯治療DVT的作用可通過(guò)參與多種生物過(guò)程而達(dá)到。

圖3 四妙勇安湯治療DVT的藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Drug?component?target?disease network of Simiao Yong'an Decoction in the treatment of DVT

運(yùn)用KEGG進(jìn)行通路富集分析，以P<0.01共得到72條通路，見圖4。結(jié)果表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGE）?糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of AGE，RAGE）信號(hào)通路、PI3K?Akt信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信 號(hào) 通路、白細(xì)胞介素?17（IL?17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、松弛素（re?laxin，RLX）信號(hào)通路等通路是關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集的通路。

表2 四妙勇安湯治療DVT關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物過(guò)程分析Tab 2 Biological process analysis of key targets of DVT treated by Simiao Yong'an Decoction

圖4 KEGG獲得的藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病通路Fig 4 Drug?component?tar get?disease pathway obtained by KEGG

3 討論

四妙勇安湯原載于鮑相璈所著的《驗(yàn)方新編》，是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的經(jīng)典名方之一［6］。方中金銀花味甘性寒，尤善清熱解毒；玄參長(zhǎng)于清熱涼血，瀉火解毒；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒、活血止痛之功。研究結(jié)果顯示，槲皮素、β?谷甾醇和山奈酚等為四妙勇安湯治療DVT的重要有效成分，可通過(guò)作用于ESR1、AR、PTGS2等關(guān)鍵靶點(diǎn)和參與AGE?RAGE信號(hào)通路、PI3K?Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、IL?17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、RLX信號(hào)通路等達(dá)到治療DVT的作用。

四妙勇安湯的有效成分：槲皮素是一種多醇羥基黃酮類化合物。Sapha等［7］通過(guò)運(yùn)用槲皮素治療I型糖尿病小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制血小板聚集以及血小板致密顆粒胞吐作用，降低血液的黏滯程度，延遲血栓的形成。β?谷甾醇是一種廣泛存在于各種植物油、堅(jiān)果等植物種子中的植物甾醇，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用［8］。牙啟康等［9］將榕樹須抗血栓作用的活性部位分離后得到的7個(gè)化合物，其中就包括β?谷甾醇，證實(shí)了其抗血栓的作用。Choi等［10］證實(shí)β?谷甾醇能夠減少TNF?α、IL?1β等炎性因子的分泌，發(fā)揮其抗炎作用。另有研究表明，β?谷甾醇在體外具有溶栓活性，在體內(nèi)能夠發(fā)揮抗凝活性［11］。山奈酚是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚能夠抑制纖維蛋白聚合物的形成，減弱凝血酶刺激血小板中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2等酶的磷酸化，延遲凝血時(shí)間［12］。這3種有效成分在藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)中作用的靶點(diǎn)多，度值較高，具有抗凝、抗炎、溶栓的藥理作用，是四妙勇安湯治療DVT的重要成分。

作用關(guān)鍵靶點(diǎn)：ESR1、AR、PTGS2等是網(wǎng)絡(luò)中的核心關(guān)鍵靶點(diǎn)。ESR1是雌激素受體的一種亞型。研究表明，ESR1能夠調(diào)節(jié)血小板前體蛋白的代謝，抑制血小板β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）生成，而血小板Aβ的過(guò)度生成可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，因此ESR1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用［13］。AR是一種主要分布于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的核受體。研究發(fā)現(xiàn)，雄激素能夠調(diào)控雄激素依賴性組織因子途徑抑制物調(diào)節(jié)蛋白（ADTRP）的水平，起到防治冠狀動(dòng)脈疾病、血栓形成等疾病的作用［14］。PTGS2基因的表達(dá)產(chǎn)生環(huán)氧合酶?2（cyclooxygen?ase?2，COX?2），環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）參與花生四烯酸合成血栓素A2的過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)血小板聚集。正常情況下COX?2的表達(dá)量很低，當(dāng)血管壁受損或者受到多種炎性因子刺激時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞COX?2的表達(dá)就會(huì)增多［15］。這些靶點(diǎn)是有效成分作用較多的靶點(diǎn)，與血管內(nèi)皮、血栓形成、血小板聚集密切相關(guān)，為四妙勇安湯治療DVT的核心靶點(diǎn)。

信號(hào)通路：AGE?RAGE信號(hào)通路與炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、血管等多方面密切相關(guān)［16］。AGE與RAGE的特異性結(jié)合能夠誘導(dǎo)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引發(fā)血管收縮、炎癥反應(yīng)等，從而導(dǎo)致血栓形成［17］。PI3K?Akt和MAPK信號(hào)通路在血小板聚集活化中發(fā)揮著重要作用［18，19］。血小板受到激動(dòng)劑刺激時(shí)，血小板表面的P2Y 1和P2Y 12受體與對(duì)應(yīng)的G蛋白發(fā)生偶聯(lián)，磷脂酰肌醇3激酶β（PI3Kβ）使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3能夠激活PI3K的下游蛋白Akt，從而導(dǎo)致血小板活化聚集以及血栓形成等反應(yīng)［20］。MAPK由ERK、JNK等蛋白組成，這些蛋白可在血小板中表達(dá)，磷酸化水平會(huì)在激動(dòng)劑的刺激下升高，并參與調(diào)節(jié)血小板的活化聚集［21］。炎癥反應(yīng)與血栓形成同屬宿主反應(yīng)，炎癥能促發(fā)血栓，而DVT中有炎癥反應(yīng)參與。炎性細(xì)胞因子作為炎癥敏感標(biāo)志物與DVT的發(fā)生密切相關(guān)［22］，IL?17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路均屬炎性反應(yīng)通路。IL?17是強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集和細(xì)胞因子的釋放，推動(dòng)炎癥的發(fā)展［23］。TNF?α能夠直接損傷血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板活化因子（platelet activated fac?tor，PAF），抑制蛋白C活化，促使血栓形成［24］。研究發(fā)現(xiàn)，IL?17和TNF?α相結(jié)合時(shí)，可以增加血小板聚集，減弱抗凝作用，導(dǎo)致血栓形成［25］。因此，四妙勇安湯可以通過(guò)發(fā)揮抗炎作用，從而抑制血栓的蔓延。RLX是一種肽類激素，能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞因子及黏附分子的表達(dá)和抑制單核細(xì)胞的黏附［26］，可以改善內(nèi)皮依賴性血管反應(yīng)，改善血管功能［27］。以上通路均為關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集的通路，與炎癥反應(yīng)、血小板聚集、血栓形成等關(guān)系密切，有效成分可能通過(guò)介導(dǎo)多條通路來(lái)發(fā)揮其藥理作用治療DVT，體現(xiàn)出四妙勇安湯多通路、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用機(jī)制。

綜上所述，四妙勇安湯中的多種成分可能通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)和介導(dǎo)多項(xiàng)通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗凝、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，從而達(dá)到治療DVT的效果。然因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄中藥信息不完全、成分與靶點(diǎn)篩選上存在主觀因素以及未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，所以本研究存在一定的局限性，四妙勇安湯治療DVT的作用機(jī)制還有待做深層次的研究加以驗(yàn)證。