醬油中呋喃酮類物質(zhì)的研究進(jìn)展

王嘉瑞，李青卓，張小龍，付彩霞，汪超，徐寧*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

醬油起源于中國(guó)，是由醬演變而來(lái)的，至今已有兩千多年的歷史。自周朝時(shí)期(公元前1046年-前256年)已經(jīng)有了醬油的記載，元、明、清以后，醬油被廣泛應(yīng)用于烹飪菜肴中，成為百姓日常生活中重要的調(diào)味佳品[1]。

醬油是以大豆或豆粕為主要原料，輔以面粉、小麥、麩皮等淀粉質(zhì)原料，在微生物的發(fā)酵作用下形成的。醬油富含生理活性物質(zhì)，在抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、防治心血管疾病等方面都有重要的功效[2]。醬油的色、香、味俱全，含有多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中對(duì)醬香味貢獻(xiàn)最大的是呋喃酮類物質(zhì)。呋喃酮類物質(zhì)為醬油貢獻(xiàn)焦糖香味和醬香味，在醬油釀造過(guò)程中產(chǎn)生HDMF和HEMF，與酵母菌生長(zhǎng)代謝息息相關(guān)，發(fā)酵條件的不同(底物、氨基酸、糖類、溫度、pH等)會(huì)極大地影響微生物的生長(zhǎng)代謝，最終影響呋喃酮類物質(zhì)的合成，從而影響醬油的風(fēng)味品質(zhì)。

1 醬油的風(fēng)味物質(zhì)

醬油的類型主要是由醬油的風(fēng)味決定的，生產(chǎn)工藝及微生物種類和含量的不同會(huì)影響醬油的品質(zhì)[3]。國(guó)內(nèi)外研究者們采用不同的定性或定量方法已經(jīng)鑒定出許多種對(duì)醬油風(fēng)味有貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)，在中國(guó)傳統(tǒng)醬油、日本味噌、泰國(guó)魚(yú)露等中共有一千多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)被檢測(cè)出。主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包含酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類、吡嗪類、呋喃(酮)類、吡喃(酮)類、吡咯類、吡啶類、含硫化合物及含氮化合物等，其中報(bào)道10次以上的化合物有66種[4]，不同種類的醬油中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量和組成差異很大。醬油特征香味中最突出的是焦糖香、烤香、果香、麥芽香，苯乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、麥芽酚、HEMF(2個(gè)互變異構(gòu)體)、葫蘆巴、HDMF和愈創(chuàng)木酚等為高鹽稀態(tài)醬油的關(guān)鍵香氣活性化合物，對(duì)醬油香氣貢獻(xiàn)最大。

在醬油制曲、醬醪發(fā)酵階段，揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生顯著變化，制曲階段醛類物質(zhì)累積，醬醪發(fā)酵階段酯、酸、呋喃酮類物質(zhì)顯著增加，此過(guò)程中不僅生成對(duì)醬油香氣貢獻(xiàn)較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，也為后續(xù)發(fā)酵提供各種酶類和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)前體物質(zhì)。

呋喃酮類物質(zhì)是醬油中香氣貢獻(xiàn)較大且種類較多的一類，主要在醬油發(fā)酵階段產(chǎn)生，其中最重要的兩種呋喃酮類化合物為HEMF和HDMF。HEMF是醬油焦糖香氣的特殊成分，在香味閾值較低時(shí)(水中0.02 mg/L)就能產(chǎn)生明顯的焦糖香、甜果香、醬香，HDMF也具有焦糖香氣，其在水中的風(fēng)味閾值為0.16 mg/L，4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(HMF)和糠醛的風(fēng)味閾值較高，但也能為醬油貢獻(xiàn)醬香味。

醬油風(fēng)味的形成機(jī)制十分復(fù)雜，與原料種類、原料配比、菌種、生產(chǎn)工藝及管理技術(shù)等有關(guān)[5]。發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)代謝，會(huì)極大地影響醬油的風(fēng)味和品質(zhì)[6]。在醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，除了會(huì)添加米曲霉外，還會(huì)添加乳酸菌、耐高鹽增香酵母菌等，在微生物的協(xié)同作用下，能產(chǎn)生有機(jī)酸、醇、酯等，這些菌株促成了發(fā)酵醬油中多種香氣物質(zhì)的生成，能夠改善醬油的風(fēng)味以提高醬油的質(zhì)量[7-8]。較常見(jiàn)的耐鹽增香酵母菌有魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)和埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)[9]。醬油釀造過(guò)程中，魯氏接合酵母能夠通過(guò)生物合成途徑或者氨基酸分解代謝途徑形成乙醇、高級(jí)醇和4-羥基呋喃酮類等物質(zhì)，調(diào)整醬油的香氣成分，影響發(fā)酵產(chǎn)品的口感，易變球擬酵母能產(chǎn)生酚類化合物如4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基酚，這兩種物質(zhì)分別賦予醬油丁香香味和煙熏味，對(duì)醬油風(fēng)味的形成起到重要作用[10]。

2 呋喃酮類物質(zhì)

呋喃酮類物質(zhì)是雜環(huán)香體類呋喃同系衍生物中極其重要的一類化合物，用途極為廣泛，是美國(guó)食用香料制造者協(xié)會(huì)(FEMA)認(rèn)可的安全食用香料，我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中也允許使用，被業(yè)界稱為“香料之王”[11]。

2.1 呋喃酮類物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

HDMF最早是在1965年被發(fā)現(xiàn)的，Rodin等[12]在菠蘿中發(fā)現(xiàn)并用乙醚萃取液首次分離出了呋喃酮，確定了其分子結(jié)構(gòu)式。1966年Henry等合成出HDMF[13]。1976年，HEMF首次在醬油中被分離出來(lái)，被認(rèn)為是醬油香氣的主體成分[14]。隨后人們陸續(xù)從草莓、芒果、牛肉湯、烤面包、杏仁、榛子等物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)HDMF[15-16]，除了水果，某些昆蟲(chóng)、細(xì)菌中也能分離出HDMF[17]，而HEMF主要存在于啤酒、味噌等發(fā)酵食品中。

2.2 呋喃酮類物質(zhì)的應(yīng)用

HEMF可用于醬油，增添獨(dú)特喜人的醬香味，并提升我國(guó)醬油的質(zhì)量；可用于白酒，增加酒的醬香味，使其氣味醇厚，回味悠長(zhǎng)；可用于果香型色酒，增加天然水果香味。HDMF是食品中重要的甜味香料和優(yōu)良的增香劑，可用于味噌、啤酒和奶酪中，也可用于調(diào)配菠蘿、草莓、牛肉等食用香精，具有顯著增香、柔和及清新作用；用于牙膏及香煙中，能夠掩蓋雜氣，除辣味，改善味道及增強(qiáng)香味，醫(yī)學(xué)上還可用來(lái)預(yù)防及治療白內(nèi)障[18]。

2.3 微生物發(fā)酵法產(chǎn)呋喃酮類物質(zhì)

呋喃酮類物質(zhì)在天然產(chǎn)物中含量很低，不能滿足日常所需，且提取純化成本較高，現(xiàn)在食品行業(yè)多以乳酸乙酯或1,2-丙二醇為原料制得呋喃酮。但化學(xué)合成法存在步驟多、產(chǎn)率低、溶劑殘留等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外研究多次報(bào)道在由酵母菌、乳酸菌等發(fā)酵的食品味噌、奶酪、啤酒等中發(fā)現(xiàn)或提取出HDMF，研究發(fā)現(xiàn)魯氏酵母、畢赤酵母、釀酒酵母、乳酸菌等微生物均能生成HDMF，魯氏酵母、埃切假絲酵母等還能夠產(chǎn)生HEMF。利用微生物發(fā)酵法制備呋喃酮可以通過(guò)調(diào)控微生物的生長(zhǎng)代謝朝著呋喃酮產(chǎn)物合成的方向進(jìn)行，且能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的綠色生產(chǎn)[19]。因此，研究微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生HEMF和HDMF增加釀造醬油中呋喃酮類物質(zhì)含量是可行的。

3 HDMF和HEMF的形成機(jī)制

由表1可知，在醬油發(fā)酵過(guò)程中形成呋喃酮類物質(zhì)主要有美拉德反應(yīng)和酵母代謝兩種途徑。糖類物質(zhì)和氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)可以形成HMF和HDMF，美拉德反應(yīng)并不能直接生成HEMF，但能夠生成HEMF的前體物質(zhì)，被酵母代謝生成HEMF。HDMF的生成大部分來(lái)源于美拉德反應(yīng)，但也有一部分來(lái)自于酵母代謝，HEMF則主要是酵母菌代謝乙醛與美拉德反應(yīng)中間代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，HMF的形成與酵母生長(zhǎng)無(wú)關(guān)，是幾種糖與磷酸鹽的非酶促反應(yīng)形成。

表1 醬油發(fā)酵過(guò)程中幾種呋喃酮類物質(zhì)的來(lái)源

3.1 美拉德反應(yīng)途徑

糖類物質(zhì)和氨基化合物在高溫下會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的過(guò)程最后生成大分子物質(zhì)，首先在酸性條件下經(jīng)過(guò)1,2-烯醇化反應(yīng)，生成羰基甲呋喃醛，隨后在堿性條件下經(jīng)2,3-烯醇化反應(yīng)，產(chǎn)生還原酮類和脫氫還原酮類，有利于Amadori重排產(chǎn)物形成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖(1-deoxysome)，它是許多食品香味的前驅(qū)體，最后Strecker降解反應(yīng)：繼續(xù)進(jìn)行裂解反應(yīng)，形成含羰基和雙羰基化合物，以進(jìn)行最后階段反應(yīng)或與氨基進(jìn)行Strecker分解反應(yīng)，產(chǎn)生Strecker醛類。

戊糖和己糖都可與甘氨酸和丙氨酸通過(guò)美拉德反應(yīng)和酵母代謝生成HEMF和HDMF的過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 HDMF和HEMF的形成途徑

通過(guò)美拉德反應(yīng)，戊糖和氨基酸在加熱條件下產(chǎn)生Amadori化合物(a)，隨后通過(guò)2,3-烯醇化(b)形成C5-1-脫氧二酮糖，酮/烯醇異構(gòu)化(C)，脫水環(huán)化(d,e)后形成HMF，己糖與氨基酸進(jìn)行類似的反應(yīng)形成C6-1-脫氧二酮糖后脫水環(huán)化形成HDMF[20]。

己糖可通過(guò)美拉德反應(yīng)生成HDMF，戊糖可通過(guò)美拉德反應(yīng)生成HMF，糖的碳骨架是形成呋喃酮類物質(zhì)環(huán)形碳骨架的決定因素。美拉德反應(yīng)生成HDMF和HMF是一種非酶促反應(yīng)，此過(guò)程沒(méi)有酵母參與也能夠進(jìn)行。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的HMF前體物質(zhì)與乙醛發(fā)生醇醛縮合(Knoevenagel縮合)(g,c)自發(fā)生成EDHMF，EDHMF能夠被酵母菌代謝產(chǎn)生的酶轉(zhuǎn)化成HEMF(i)。

3.2 酵母代謝途徑

HEMF的形成很可能與戊糖磷酸途徑的中間產(chǎn)物有關(guān)，戊糖磷酸鹽途徑是酵母產(chǎn)生HEMF最重要的途徑[21]。美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物C5-1-脫氧二酮糖可以與甘氨酸或丙氨酸的Strecker降解(f)產(chǎn)物甲醛和乙醛或者是糖片段化(h)產(chǎn)生的甲醛和乙醛通過(guò)2,3-烯醇化(b)形成C6-1-脫氧二酮糖和C7-1-脫氧二酮糖，隨后脫水縮合碳鏈環(huán)化(d,e)產(chǎn)生環(huán)狀中間體，通過(guò)酮/烯醇互變異構(gòu)(c)還原成HDMF和HEMF，此步驟需要酵母菌參與代謝(i)，HEMF五元環(huán)的骨架和側(cè)鏈的甲基是由核糖形成的，乙基則來(lái)自于酵母利用丙氨酸Strecker降解產(chǎn)物(或是糖片段化(h)性的)乙醛[22]。戊糖和甘氨酸或丙氨酸通過(guò)美拉德反應(yīng)和酵母代謝可以生成HDMF和HEMF。

草莓和番茄果實(shí)中有一種烯酮氧化還原酶，能夠催化HDMF的合成[23]。酵母中HEMF的形成是一種酶促反應(yīng)，通過(guò)酵母菌產(chǎn)生的酶也可催化HDMF的生成。酵母菌內(nèi)含有一種YNL134C基因，能夠編碼與植物的烯酮氧化還原酶(enone oxidoreductase)具有低序列同源性的醛還原酶，能夠調(diào)控HDMF和HEMF的合成。YNL134C基因編碼是一種醛還原酶活性的新型蛋白，由酵母細(xì)胞合成并釋放到體外，可以將多種醛還原成相應(yīng)的醇，將糠醛和HMF解毒成毒性較低的2-呋喃甲醇(FM)和呋喃-2,5-二甲醇(FDM)[24]。糖類與氨基酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、乙醛和NADPH在加熱條件下能夠生成EDHMF，在添加YNL134C編碼的酶后還原成HEMF[25]。此外，魯氏酵母中還含有17種與酵母生長(zhǎng)代謝EMP途徑和戊糖磷酸途徑相關(guān)的基因，能夠影響HDMF和HEMF的生物合成[26]。

研究發(fā)現(xiàn)敲除YNL134C基因?qū)е箩劸平湍窰EMF產(chǎn)量下降。而多克隆表達(dá)該基因?qū)е翲EMF產(chǎn)量增加，因此可以通過(guò)找尋能添加到醬油釀造中包含類似于YNL134C基因編碼的醛還原酶以及類似植物烯酮氧化還原酶的基因的高產(chǎn)HEMF微生物來(lái)完善醬油中呋喃酮類物質(zhì)的形成機(jī)制，也可以通過(guò)基因改造積累產(chǎn)生呋喃酮類物質(zhì)的前體物質(zhì)，通過(guò)調(diào)控微生物中催化HEMF和HDMF合成的酶的基因來(lái)增加HEMF和HDMF的含量[27]。

3.3 HDMF和HEMF合成的影響因素

HDMF的生成大部分來(lái)源于美拉德反應(yīng)，在加熱條件下HDMF的含量明顯增加，加入酵母后含量無(wú)明顯變化。HEMF不能由美拉德反應(yīng)直接產(chǎn)生，是由酵母菌代謝乙醛和美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物生成。培養(yǎng)基的理化條件不同，如不同的底物、不同的氨基酸、不同的糖類添加、不同的接種方式、不同的生產(chǎn)工藝均會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)代謝，最終影響HDMF和HEMF的合成。有研究表明，培養(yǎng)基的NaCl濃度和pH能影響魯氏酵母的生長(zhǎng)代謝，在菌體能正常生長(zhǎng)的前提下高鹽濃度更能促進(jìn)HDMF和HEMF的合成，可能是高鹽條件下細(xì)胞通透性改變，對(duì)底物有更高的選擇性[28]。

在醬油體系中，魯氏酵母可利用不同的糖類和氨基酸類物質(zhì)生成呋喃酮類物質(zhì)，有研究表明添加五碳糖更能增加醬油的醬香味和煙熏味，可能是因?yàn)槲逄继遣灰妆晃⑸锷L(zhǎng)作為能源，但卻是美拉德反應(yīng)重要的前體物質(zhì)，添加1,6-二磷酸果糖更容易被酵母菌利用，也能夠增加HDMF和HEMF的產(chǎn)量[29]。不同的氨基酸添加對(duì)酵母合成呋喃酮有不同的影響，除酪氨酸(Tyr)對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF有抑制作用外，其余19種氨基酸均有不同的促進(jìn)作用，其中，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)的促進(jìn)作用最明顯[30]。因此可以通過(guò)改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境來(lái)影響微生物的代謝，讓結(jié)果朝著更有利于酵母菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生更多香氣成分呋喃酮的方向發(fā)展。

4 發(fā)展與展望

傳統(tǒng)的醬油釀造是指前人無(wú)意識(shí)地利用了自然的混菌發(fā)酵，由自然環(huán)境中多種微生物群體參與，微生物之間拮抗共生，產(chǎn)生了豐富的酶系，使傳統(tǒng)釀造的醬油具有很好的風(fēng)味?，F(xiàn)代醬油釀造工藝往往是純種發(fā)酵，通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控生產(chǎn)工藝來(lái)嚴(yán)格控制醬油的品質(zhì)。目前人們對(duì)發(fā)酵醬油的工藝機(jī)理，尤其是發(fā)酵醬油用功能微生物缺乏深刻認(rèn)識(shí)和系統(tǒng)研究。隨著生活水平的提高，人們對(duì)醬油風(fēng)味的要求越來(lái)越高，醬油的風(fēng)味已成為食品生產(chǎn)者和消費(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題。原材料的配比、接種微生物的種類以及生產(chǎn)工藝決定了醬油的色、香、味。了解醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類及其產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)于如何改造耐高鹽增香酵母從而改善醬油風(fēng)味及提高醬油質(zhì)量至關(guān)重要，為進(jìn)一步精準(zhǔn)調(diào)控發(fā)酵調(diào)味品風(fēng)味提供了思路。