釀造醬油微生物多樣性及風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展

譚戈，徐晴元，郭麗瓊*，鄭倩望，鄒苑，潘濤，林俊芳*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.廣東微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

醬油，作為一種調(diào)味品，深受中國、日本等亞洲國家的歡迎[1]。在釀造醬油國家標(biāo)準(zhǔn)中，依據(jù)發(fā)酵工藝的不同，將醬油劃分為低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油和高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油。前者發(fā)酵周期較短、成本較低，但口感較差；后者質(zhì)量高，鮮味和香氣濃郁，但發(fā)酵周期較長，一般要6個(gè)月[2]。

低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油，是以大豆、麩皮和麥粉為主要原料，經(jīng)過蒸煮、制曲過程后，與鹽水混合成固態(tài)醬醅，再經(jīng)發(fā)酵而成的醬油。高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，是以大豆和小麥為主要原料，經(jīng)蒸煮、曲霉菌制曲后與鹽水混合成稀醪，再經(jīng)發(fā)酵而成的醬油。在整個(gè)發(fā)酵過程中，重要參與者是微生物以及其產(chǎn)生的多種酶系，最終產(chǎn)生了醇類、酸類、酚類、酯類、醛類、呋喃類和吡嗪類等風(fēng)味物質(zhì)[3]。

醬油不僅是一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，還有抗氧化、降血壓等功能，被稱為“養(yǎng)生醬油”[4-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[6]，2015-2018年，中國醬油的年產(chǎn)量連續(xù)4年下降，2018年中國醬油產(chǎn)量降至576萬噸，當(dāng)前中國醬油市場呈現(xiàn)出不容樂觀的趨勢。而日本的醬油企業(yè)對(duì)傳統(tǒng)醬油進(jìn)行研究，結(jié)合醬油生產(chǎn)技術(shù)，使其質(zhì)量和風(fēng)味更佳，深受消費(fèi)者的歡迎，使得日本醬油在全球市場排名領(lǐng)先[7]。羅龍娟等[8]對(duì)日式醬油和中式醬油的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究，鑒定出日式醬油中共有125種風(fēng)味物質(zhì)，種類比中式醬油多31種，其中酯類含量更是高出32%。隨著消費(fèi)者消費(fèi)水平的提高及對(duì)健康的追求，促進(jìn)了醬油走向高端市場，如原釀本味醬油和“減鹽不減鮮”的特質(zhì)健康醬油[9]。

20世紀(jì)60年代，學(xué)者們開始研究醬油發(fā)酵過程中所參與的微生物群落，嘗試揭開釀造醬油的相關(guān)菌株和風(fēng)味菌的種類構(gòu)成。從傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法到磷脂脂肪酸分析法，再到基因指紋圖譜分析法、變性梯度凝膠電泳技術(shù)和基因組學(xué)。對(duì)于釀造醬油風(fēng)味物質(zhì)的鑒定技術(shù)也是多樣化和現(xiàn)代化，如電子鼻和電子舌聯(lián)用技術(shù)、氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀、固相微萃取等。本文對(duì)醬油釀造過程中微生物的多樣性以及風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，將醬油微生物的多樣性和風(fēng)味物質(zhì)聯(lián)系起來，為研發(fā)優(yōu)質(zhì)醬油提供了一定理論依據(jù)。

1 釀造醬油的微生物多樣性

1.1 釀造醬油的微生物多樣性分析

醬油的釀造離不開多種微生物的協(xié)同作用，微生物菌群在醬油釀造過程中呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，不少研究者對(duì)醬油發(fā)酵過程中微生物的動(dòng)態(tài)變化過程進(jìn)行了剖析。在醬油釀造過程中，微生物群落由非耐鹽和耐酸性較差的優(yōu)勢菌株向耐鹽性和耐酸性較強(qiáng)的菌株為主演變。

Zhang等[10]運(yùn)用磷脂脂肪酸分析法(phospholipid fatty acid，PLFA)和變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，對(duì)兩種發(fā)酵醬油模式(低鹽固態(tài)發(fā)酵和高鹽稀態(tài)發(fā)酵)的醬醪發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行菌落形態(tài)分析，得知醬醪發(fā)酵中以革蘭氏陽性菌(魏斯氏菌、四聯(lián)球菌)和真菌(接合酵母、畢赤氏酵母和假絲酵母)為優(yōu)勢菌群。

胡傳旺[11]利用微生物多樣性測序方法，對(duì)釀造醬油的整個(gè)過程進(jìn)行微生物多樣性的動(dòng)態(tài)分析。在醬油成曲階段，菌群主要由米曲霉、乳酸菌、葡萄球菌和芽孢桿菌組成；在醬醪發(fā)酵體系中，真菌主要由米曲霉、魯氏接合酵母和假絲酵母組成，細(xì)菌主要由嗜鹽片球菌、魏斯氏菌和葡萄球菌組成。Wang等[12]利用宏基因組學(xué)手段研究醬油細(xì)菌的種類，發(fā)現(xiàn)在醬油制曲階段存在29個(gè)細(xì)菌種屬，優(yōu)勢菌為庫特氏菌、魏斯氏菌和葡萄球菌；醬醪階段存在34個(gè)種屬，優(yōu)勢菌為庫特氏菌、葡萄球菌和腸球菌。Sulaiman等[13]以中國傳統(tǒng)醬油醬醪為研究對(duì)象，在發(fā)酵的6個(gè)月過程中，定期采集醬醪樣本以監(jiān)測其微生物數(shù)量和功能特性的變化。通過全基因組鳥槍法分析得知發(fā)酵醬醪以魏斯氏菌屬為主，真菌屬以假絲酵母屬為主。

1.2 釀造醬油發(fā)酵主要微生物

醬油發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是微生物共同作用的一系列活動(dòng)，參與的微生物種類繁多，主要有米曲霉、酵母菌和乳酸菌3種類型。多菌種發(fā)酵體系，在提高了醬油原料利用率的同時(shí)，也提高了醬油中糖、氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)的含量，有利于改善醬油的風(fēng)味和提高醬油的營養(yǎng)價(jià)值。Yan等[14]利用微生物培養(yǎng)法，對(duì)醬油制曲過程進(jìn)行了微生物鑒定實(shí)驗(yàn)，分析得出醬油制曲階段中占優(yōu)勢的菌群有米曲霉、假絲酵母、乳酸菌和葡萄球菌。

1.2.1 米曲霉

米曲霉(Aspergillusoryzae)是曲霉關(guān)鍵生產(chǎn)菌種之一，目前國內(nèi)常用的菌株有AS3.951(滬釀3.042)、UE328、UE336、渝3.811。米曲霉具有多種復(fù)合酶系，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和谷氨酰胺酶，它將醬油原料中的淀粉、蛋白質(zhì)分解為糖類和氨基酸等成分，為微生物的生長和發(fā)酵過程提供了營養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，由于米曲霉具有繁殖能力強(qiáng)、抑制雜菌能力強(qiáng)、酶活力高和制曲時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，成為醬油生產(chǎn)菌株研究的熱點(diǎn)。Ding等[15]發(fā)現(xiàn)以米曲霉3.042為基礎(chǔ)，構(gòu)建了穩(wěn)定產(chǎn)生單核孢子的米曲霉3.042-3，最后轉(zhuǎn)化為新菌株3.042-3-c。在醬油發(fā)酵時(shí)，新菌株3.042-3-c發(fā)酵醬油的風(fēng)味成分種類和含量比米曲霉3.042和米曲霉3.042-3高，尤其是醇類和酯類物質(zhì)。邵偉等[16]以滬釀3.042為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變與化學(xué)誘變，篩選培育出變異菌株A11，發(fā)現(xiàn)該菌株比滬釀3.042的蛋白酶活性比提高了110%，耐溫性能較強(qiáng)，遺傳性狀較穩(wěn)定。

1.2.2 酵母菌

酵母菌(Saccharomyce)也是釀造醬油發(fā)酵的重要微生物之一，該菌可以利用糖類產(chǎn)生醇類物質(zhì)，對(duì)醬油的風(fēng)味形成具有重要作用[17]。目前，從醬油醬醪中分離出30多種酵母菌，如魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、球擬酵母(Torulopsis)和埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)[18]。當(dāng)前研究最多的是魯氏接合酵母，它將葡萄糖轉(zhuǎn)化成醇，同時(shí)產(chǎn)生呋喃酮、醇類等風(fēng)味物質(zhì)。Song等[19]從韓國酵母中分離出產(chǎn)高乙醇的徳氏環(huán)孢菌(Torulasporadelbrueckii)和高風(fēng)味的龜裂畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)，并將其應(yīng)用于低鹽醬油發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)其風(fēng)味更濃郁，還有抑制腸球菌等致病菌的作用。呂變梅等[20]通過紫外誘導(dǎo)，得到一株發(fā)酵能力強(qiáng)的魯氏接合酵母L6-1，利用該菌株釀造的醬油較空白組多了20種風(fēng)味物質(zhì)。

在醬油工業(yè)中，酵母屬的發(fā)酵工藝技術(shù)的發(fā)展較為成熟。牟燦燦等[21]在釀造醬油的醬醪發(fā)酵后期接種球擬酵母和魯氏酵母等增香酵母，發(fā)現(xiàn)成品醬油中酯類和醇類的種類和含量均比空白組明顯提高。此外，在醬醪液的早期發(fā)酵階段，檢測到了魯氏接合酵母；中期發(fā)酵階段，埃切假絲酵母和易變假絲酵母(Candidaversatilis)被檢測到；成熟發(fā)酵階段，埃切假絲酵母被檢測到。結(jié)果表明，醬油生產(chǎn)過程中存在的酵母菌群落在整個(gè)生產(chǎn)過程中發(fā)生了巨大變化[22]。

1.2.3 乳酸菌

從醬油醬醪中分離出來的還有乳酸菌(Lactobacillus)，在醬油發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，在發(fā)酵過程中快速增長，抑制雜菌生長。乳酸菌主要包括嗜鹽片球菌(Pediococcushalophilus)、嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和魏斯氏菌(Weissella)[23]。嗜鹽片球菌在常溫高鹽狀態(tài)下生長良好，最適pH為5.0～6.0。它主要是在發(fā)酵前期生長繁殖，產(chǎn)生有機(jī)酸，降低醬油中的pH，從而有利于酵母菌的生長。在發(fā)酵后期，隨著體系中pH持續(xù)下降，該菌會(huì)停止生長。四聯(lián)球菌是一種嗜鹽乳酸菌，作用與嗜鹽片球菌類似，最終也會(huì)停止生長。植物乳桿菌是醬油產(chǎn)生風(fēng)味的主要來源菌，保證了釀造醬油的質(zhì)量與風(fēng)味。魏斯氏菌廣泛存在于發(fā)酵食品中，如泡菜、豆豉和醬油中，對(duì)食品有機(jī)酸、酯類和短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的生成有著重要的意義。

2 醬油風(fēng)味物質(zhì)分析

2.1 醬油風(fēng)味物質(zhì)分析

評(píng)價(jià)醬油的好壞，不僅取決于其營養(yǎng)價(jià)值，風(fēng)味物質(zhì)也是一個(gè)不可或缺的指標(biāo)。風(fēng)味的形成包括香氣和滋味兩個(gè)方面，其中香氣來源于醇類、酸類、酯類、醛類、呋喃類和吡嗪類等；滋味由鮮、甜、酸、咸和苦組成。然而僅僅依據(jù)這些物質(zhì)來描述醬油風(fēng)味是不夠的，主要是因?yàn)檫@些風(fēng)味物質(zhì)會(huì)相互作用，使釀造出來的醬油風(fēng)味更獨(dú)特。

2.1.1 醬油中香氣物質(zhì)的分析

隨著現(xiàn)代分析儀器和手段的發(fā)展，有近300種醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)已被分離和鑒定，確定了4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、4-乙基俞創(chuàng)木酚和3-甲硫基丙醇等為醬油醬香的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[24]。趙謀明等[25]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS)共分離鑒定出109種醬油揮發(fā)性化合物，其中醇類含量最高，達(dá)75.82%，而醛類、酯類、酸類和呋喃類含量依次減少。方冠宇等[26]采用多菌種混合發(fā)酵技術(shù)和頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析了醬油的風(fēng)味物質(zhì)，驗(yàn)證了隨著菌種種類的增加，釀造醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)亦會(huì)增多，見表1。Liu等[27]用米曲霉和嗜鹽性酵母同時(shí)接種制曲，可顯著提高乙酸乙酯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和1-辛烯-3-醇的含量，獲得的醬油醬香風(fēng)味更濃郁，也驗(yàn)證了隨著醬油發(fā)酵菌種種類的增加，醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)含量也越多這一觀點(diǎn)。

表1 多菌種高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵完成時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類的比較

Inoue等[28]在醬油中檢測到41種香氣活性物質(zhì)并進(jìn)行感官評(píng)估，結(jié)果表明新鑒定出來的二甲基三硫化物有利于提高醬油的鮮味。Feng等[29]采用HS-SPME和氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS)兩種技術(shù)，研究了兩種中國發(fā)酵醬油的香味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)高鹽稀態(tài)醬油的香氣風(fēng)味物質(zhì)更為豐富，包括乙醇、3-甲基丁醇等37種風(fēng)味物質(zhì)。

Harada等發(fā)現(xiàn)醬油微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)醬油香氣的形成存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加乙醇生香單一，說明醬油的香氣成分是由酵母代謝產(chǎn)生的，并非由乙醇直接轉(zhuǎn)化而來。大多數(shù)醬油香氣物質(zhì)與微生物代謝有關(guān)聯(lián)，同時(shí)一些香氣物質(zhì)的產(chǎn)生也與原料的處理和滅菌溫度有關(guān)[30]。

2.1.2 醬油中滋味物質(zhì)的分析

醬油的滋味可以用鮮、甜、酸、咸和苦這5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。鮮味是評(píng)價(jià)醬油品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。它主要來源于鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、鮮味肽和酵母菌自溶時(shí)產(chǎn)生的核苷酸[31]。甜味主要來源于淀粉水解后所產(chǎn)生的糖，如葡萄糖、麥芽糖等，還有一部分來自甜味氨基酸，如蘇氨酸、丙氨酸和脯氨酸等[32]。酸味主要來自有機(jī)酸物質(zhì)，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和檸檬酸等20多種有機(jī)酸。酸味物質(zhì)之間的協(xié)同作用對(duì)醬油的獨(dú)特風(fēng)味起到了關(guān)鍵性作用。此外，有機(jī)酸改善了醬油醬醪體系的pH[33]，在抑制雜菌生長的同時(shí)，還會(huì)降低醬油生物胺產(chǎn)量及其產(chǎn)生的胺臭味。咸味主要來自醬油釀造過程中添加的食鹽。在高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中，添加食用鹽不僅會(huì)抑制雜菌生長，還會(huì)結(jié)合氨基酸，形成氨基酸鹽，為醬油添加獨(dú)有的鮮味。苦味主要來自食用鹽中的硫酸鎂、氯化鎂和苦味氨基酸和苦味肽。微苦可以給醬油帶來一種醇厚感，也是釀造醬油獨(dú)特風(fēng)味的基礎(chǔ)之一。總體而言，醬油滋味以鮮味為主，兼甜、酸、咸、苦五味調(diào)制而成的復(fù)合體，味道咸鮮、微甜而醇。

2.2 微生物與風(fēng)味物質(zhì)

在釀造醬油的過程中，多種微生物對(duì)原料中淀粉、大豆蛋白的利用，產(chǎn)生了醬油的風(fēng)味，此外微生物菌群還可以進(jìn)一步產(chǎn)生各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的相互作用，形成了醬油的獨(dú)特風(fēng)味，微生物對(duì)醬油風(fēng)味形成的作用見表2。

表2 微生物對(duì)醬油風(fēng)味形成的作用

許瑜[37]發(fā)現(xiàn)外加糖源能顯著提高醬油的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，如4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，其中添加木糖后，可以提高醬醪中酵母菌的數(shù)量，加深醬油的色澤度，而添加葡萄糖后可以提高醬醪中乳酸菌數(shù)量以及醬油的鮮味(如谷氨酸)和甜味(如丙氨酸、賴氨酸)。Kong等[38]采用高效液相色譜法測定10種市售醬油主要的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和谷氨酸的含量為8.77～147.98 mg/mL。乳酸(0.83～13.19 mg/mL)和焦谷氨酸(從0～12.80 mg/mL)是主要的有機(jī)酸，有助于提高酸度，確保醬油的口感均衡。

乳酸菌群落對(duì)糠醛、糠醇、甲硫基丙醛、甲基環(huán)戊烯醇、有機(jī)酸和酯類等風(fēng)味物質(zhì)的形成有較大的影響，Jiang等展示了天然醬油發(fā)酵微生物群落中的一種細(xì)菌，即芽孢桿菌，經(jīng)改造后的菌株可以有效減少醬油的“褐變”反應(yīng)，同時(shí)也能產(chǎn)生鮮味物質(zhì)，為醬油增添香氣。

近年來，也有不少科研人員通過添加不同的菌種來提高醬油的風(fēng)味。胡傳旺等[39]從日本醬油的醬醪發(fā)酵過程中分離出9株細(xì)菌，在高鹽條件下對(duì)它們的特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌B2產(chǎn)蛋白酶和糖化酶的能力較強(qiáng)，類腸膜魏斯氏菌CQ03可水解原料產(chǎn)生較多鮮味氨基酸，嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)有機(jī)酸能力較強(qiáng)，這些菌和風(fēng)味物質(zhì)的相互作用大大增強(qiáng)了醬油的風(fēng)味。Liang等[40]以嗜鹽四聯(lián)球菌、魯氏接合酵母和假絲酵母作為醬油補(bǔ)充添加發(fā)酵劑，明顯提高了發(fā)酵醬油的品質(zhì)。

3 展望

釀造醬油及其獨(dú)特的風(fēng)味離不開微生物的新陳代謝活動(dòng)，它們是由多種微生物共同作用而形成的。當(dāng)前，中國醬油行業(yè)雖然正處于高速發(fā)展期，醬油生產(chǎn)技術(shù)也在不斷完善，但總體在高端醬油品牌市場的認(rèn)可度不高，仍存在較大的短板，如“零添加”醬油防腐、減鹽醬油帶來的營養(yǎng)成分和風(fēng)味不佳等現(xiàn)象，無法滿足消費(fèi)者所追求的質(zhì)量高、鮮味足的健康醬油需求。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如基因組學(xué)、GC-MS、代謝組學(xué)等手段，來研究釀造醬油中微生物群落的多樣性、微生物相互作用機(jī)理及調(diào)控技術(shù)、風(fēng)味菌以及醬油風(fēng)味物質(zhì)成分，優(yōu)化釀造醬油的發(fā)酵菌種以及風(fēng)味菌的種類和比例，篩選出更優(yōu)質(zhì)的醬油新菌株，為生產(chǎn)更優(yōu)的質(zhì)醬油提供一定的理論依據(jù)和新思路，來解決醬油生產(chǎn)周期長、減鹽后風(fēng)味不佳和營養(yǎng)價(jià)值下降等突出問題，促進(jìn)特質(zhì)健康醬油釀造工藝的發(fā)展，更好地滿足消費(fèi)者的需求。