固相萃取結(jié)合薄層色譜法測(cè)定蜂蜜中高果糖淀粉糖漿

馬凱，楊昌彪*，黃永橋，吳新文，簡(jiǎn)銀池

(1.貴州省分析測(cè)試研究院，貴陽(yáng) 550000；2.貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴陽(yáng) 550000)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]，其主要成分為果糖、葡萄糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和酶[2]，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是良好的藥用輔料，并作為食品調(diào)味配料應(yīng)用于多種食品中[3-6]。近些年來(lái)，隨著人民的生活水平提高，對(duì)于蜂蜜的需求量迅速增加，但是天然蜂蜜的產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)需求，價(jià)格相對(duì)較高，少數(shù)不法商人在天然蜂蜜中摻加各種低廉的糖漿，如果葡糖漿、麥芽糖漿等，以此牟利，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者和正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的利益[7]，因此，有必要對(duì)蜂蜜摻假與真?zhèn)蔚臋z測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究。目前，蜂蜜摻假檢測(cè)方法已由感官、理化指標(biāo)、花粉鑒別等傳統(tǒng)品質(zhì)檢測(cè)方法[8]，發(fā)展到現(xiàn)代分析技術(shù)，主要有碳穩(wěn)定同位素分析法、色譜分析法、光譜分析法、酶活性法、差熱分析法等[9-15]，這些檢測(cè)方法都有各自的特點(diǎn)和一定的適用范圍。其中，薄層色譜法由于對(duì)設(shè)備和操作要求較低，且對(duì)蜂蜜中摻入的高果糖淀粉糖漿能準(zhǔn)確辨別，被廣泛應(yīng)用，我國(guó)也在美國(guó)AOAC方法《蜂蜜中高果糖淀粉糖漿——薄層色譜測(cè)定法》進(jìn)行了編輯性修改，形成了GB/T 18932.2-2002《蜂蜜中高果糖淀粉糖漿測(cè)定方法 薄層色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。

本研究在GB/T 18932.2-2002標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，擬采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃層析柱，對(duì)前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，再用薄層色譜法分離、檢測(cè)，建立了蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

無(wú)水乙醇、丙酮：分析純，成都市科龍化工試劑廠；正丁醇(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；冰乙酸(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸(優(yōu)級(jí)純，≥85%)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二苯胺鹽酸鹽、苯胺：分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水；F55果葡糖漿：山東香馳健源生物科技有限公司；原料為食用玉米淀粉。

薄層展開(kāi)劑的配制：正丁醇+水+乙酸(2+1+1)。

顯色劑的配制：稱取1.0 g二苯胺鹽酸鹽，至盛有50.0 mL丙酮的錐形瓶中，再加入1 mL苯胺，同時(shí)加入5 mL磷酸，超聲至完全溶解，冷凍保存或臨用前配制。

薄層層析板：硅膠G板(青島海洋化工有限公司，規(guī)格200 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm)，使用前應(yīng)畫(huà)板，在距離薄層板下端2.0 cm的位置畫(huà)線，此線為爬板起始線，在薄層板的左右兩邊各留2 cm，并在起始線上水平每間隔2 cm處標(biāo)記，作為點(diǎn)板位置，從起始線向上量10 cm的位置畫(huà)線，此線為爬板終點(diǎn)線，層析板使用前應(yīng)置于110 ℃恒溫干燥箱中活化1 h，并置于干燥器中冷卻至室溫，備用；固相萃取小柱(規(guī)格6 mL)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；微量注射器(10 μL)：美國(guó)安捷倫公司；顯色噴霧瓶(規(guī)格50 mL)：姜堰東方科教儀器廠；50 mL棕色雞心瓶；薄層色譜展開(kāi)槽(200 mm×200 mm，雙槽)。

1.2 儀器與設(shè)備

202型電熱恒溫干燥箱 永光明醫(yī)療儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；真空抽氣泵(SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵)；分析天平 常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；多管旋渦混合器 北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q實(shí)驗(yàn)室超純水制備系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；SK250HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；12管固相萃取裝置 美國(guó)Supelco公司；5～50 mL瓶口分液器 德國(guó)普蘭德公司；XW-80A型旋渦混合器 蘇州江東精密儀器有限公司；移液器(100～1000 μL、1～5 mL) 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電吹風(fēng)機(jī)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的制備

有結(jié)晶的樣品，在密閉的情況下，置于不超過(guò)60 ℃的水浴鍋中，待樣品全部融化后混合均勻，迅速冷卻至室溫，待稱量；無(wú)結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品，混合均勻后，備用。

1.3.2 提取與凈化

提?。悍Q取2 g(精確到0.01 g)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水后，置于多管旋渦混合器渦旋溶解，待固相萃取小柱凈化?；罨合纫?5 mL水預(yù)洗小柱，流速為1滴/s，待液相距離上層篩板約2 mm處，開(kāi)始上樣；上樣：溶解液全部過(guò)柱，流速控制在1滴/s，棄掉流出液；淋洗：以25 mL 7%乙醇水溶液進(jìn)行淋洗，棄去淋洗液；洗脫：用10 mL 50%的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，流速控制在1滴/s，抽干，收集全部洗脫液，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色雞心瓶中，待濃縮。濃縮：將洗脫液置于65 ℃水浴中減壓濃縮至干，加入0.50 mL 30%的乙醇水溶液，搖勻，充分溶解，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，作為供試品溶液待薄層色譜分析。

1.3.3 對(duì)照樣品的制備與保存

選取不含糖漿的純蜂蜜作為陰性對(duì)照樣品，并添加果葡糖漿，制備含有5%、10%糖漿的蜂蜜作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，按照1.3.2步驟操作，制備供試品溶液，可以一次制備冷凍保存，多次使用。

1.3.4 薄層層析

薄層展開(kāi)：用10 μL微量進(jìn)樣針在距離薄層板下端2 cm的位置，同時(shí)水平間隔2 cm，按照標(biāo)記好的點(diǎn)，少量多次地點(diǎn)上6.0 μL的供試品溶液，并點(diǎn)上同樣量經(jīng)過(guò)處理的純蜂蜜和含有5%、10%糖漿的對(duì)照品溶液；點(diǎn)樣結(jié)束后，把薄層板放入展開(kāi)槽中(薄層展開(kāi)前，展開(kāi)槽加入30 mL展開(kāi)劑，液面高度約為0.5 cm，蓋好蓋板，蒸汽預(yù)飽和15 min)，按傾斜向上法展開(kāi)，當(dāng)展開(kāi)劑前沿到達(dá)標(biāo)記好的爬板終點(diǎn)線時(shí)，從展開(kāi)槽中取出薄層板，晾干或者用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，預(yù)計(jì)展開(kāi)時(shí)間為150～180 min。顯色：把顯色劑用噴霧瓶均勻噴霧在薄層板上，等溶劑完全揮發(fā)后，放入105 ℃的恒溫干燥箱中烘15 min，使之顯色。

1.3.5 結(jié)果判定

觀察顯色情況，純蜂蜜在比移值Rf=0.35以上的區(qū)域只有2～3個(gè)藍(lán)色中帶灰色或咖啡色的斑點(diǎn)，混有糖漿的蜂蜜卻是從原點(diǎn)開(kāi)始呈現(xiàn)出藍(lán)色帶狀樣的斑點(diǎn)群，因此，假如從原點(diǎn)開(kāi)始到Rf=0.35位置附近有藍(lán)色帶狀斑點(diǎn)群出現(xiàn)，應(yīng)考慮蜂蜜樣品中混有淀粉轉(zhuǎn)化來(lái)的高果糖淀粉糖漿，可以判定為陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。點(diǎn)樣量為6 μL時(shí)，檢出限為含有5%的糖漿。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的選擇

純蜂蜜和高果糖淀粉糖漿中絕大部分糖類是單糖，還含有少量的二糖，純蜂蜜中含有3%～4%的低聚糖，不含高分子糖，而高果糖淀粉糖漿含有微量高分子糖，因此，可根據(jù)糖成分的不同，隨著糖鏈的增加，結(jié)合薄層色譜，其比移值Rf相應(yīng)降低，來(lái)區(qū)分純蜂蜜和摻有高果糖淀粉糖漿的蜂蜜。在用薄層色譜展開(kāi)前，需要除去樣品中單糖和二糖的干擾，并分離和富集其中的高分子糖。在GB/T 18932.2-2002中，使用2.0 g硅藻土、12.0 g活性炭和硅藻土混合物(1+1)、2.0 g硅藻土，加水，依次自然沉降堆積，制得活性炭玻璃層析柱；上樣后，并分別用500 mL水預(yù)洗，300 mL乙醇溶液(7+93)淋洗，100 mL乙醇溶液(1+1)洗脫；洗脫液用旋蒸蒸發(fā)儀濃縮蒸干后，在真空干燥箱中干燥，干燥完畢后，稱取雞心瓶的質(zhì)量，計(jì)算溶出物的質(zhì)量，按每10 mg溶出物加0.1 mL水的比例，加水溶解，以備薄層色譜分析用。標(biāo)準(zhǔn)方法在實(shí)際操作過(guò)程中，活性炭玻璃層析柱因長(zhǎng)度較長(zhǎng)，填料較多，增加了液體的流動(dòng)阻力，同時(shí)需要溶劑的量較大，所需的實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于批量操作，增加了檢測(cè)成本；同時(shí)，在層析柱分離和富集的過(guò)程中，需要持續(xù)保持在負(fù)壓狀態(tài)下，少量的填料會(huì)通過(guò)玻璃棉進(jìn)入到接收瓶中，影響溶出物質(zhì)量的準(zhǔn)確性。

本研究采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃層析柱，對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，具體步驟見(jiàn)1.3.2，優(yōu)化的方法減少了硅藻土、活性炭和試劑使用量，溶出物加入0.50 mL水直接溶解的方式，縮短了前處理過(guò)程的時(shí)間，見(jiàn)表1，并結(jié)合固相萃取裝置，可以進(jìn)行批量樣品的同時(shí)處理，降低了檢測(cè)成本和提高了檢測(cè)效率。

表1 不同前處理過(guò)程的對(duì)比

2.2 薄層色譜展開(kāi)結(jié)果

采用本研究方法與GB/T 18932.2-2002方法分別對(duì)純蜂蜜及添加外源糖漿的陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行處理，并在硅膠薄層板上展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 薄層色譜法測(cè)定樣品的結(jié)果

由圖1可知，1號(hào)、2號(hào)和5號(hào)是按照本研究方法進(jìn)行前處理，其中1號(hào)為含10%高果糖漿的蜂蜜，2號(hào)為含5%高果糖漿的蜂蜜，5號(hào)為純蜂蜜；3號(hào)、4號(hào)和6號(hào)是按照GB/T 18932.2-2002進(jìn)行前處理，其中3號(hào)為含5%高果糖漿的蜂蜜，4號(hào)為含10%高果糖漿的蜂蜜，6號(hào)為純蜂蜜。由圖1可以看出1，2，3，4號(hào)除了在Rf>0.35處出現(xiàn)了斑點(diǎn)外，在從近原點(diǎn)處開(kāi)始呈現(xiàn)藍(lán)色帶狀斑點(diǎn)群，判定結(jié)果為陽(yáng)性，5，6號(hào)在Rf>0.35處出現(xiàn)了大斑點(diǎn)，在Rf<0.35位置薄層板比較干凈，未出現(xiàn)斑點(diǎn)，判定結(jié)果為陰性。比較本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法所得譜圖，結(jié)果顯示兩種試驗(yàn)結(jié)果一致，表明本研究方法可以對(duì)蜂蜜中高果糖淀粉糖漿進(jìn)行定性判斷。

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的適用性，選取了實(shí)驗(yàn)室收集和市場(chǎng)采購(gòu)的共計(jì)45個(gè)蜂蜜樣品，按照本研究建立的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，對(duì)這些蜂蜜按照GB 5009.8-2016的方法，測(cè)定了果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量，以及按照GB/T 18932.1-2002的方法，測(cè)定蜂蜜中碳-4植物糖的百分含量，通過(guò)這些指標(biāo)判斷選取的蜂蜜是否有外源性植物糖漿的摻入，蜂蜜樣品測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蜂蜜樣品測(cè)定結(jié)果

續(xù) 表

由表2可知，在45個(gè)蜂蜜樣品中共有8個(gè)樣品摻入了外源性植物糖漿，占總體樣品的17.78%。

根據(jù)2020年版的中國(guó)藥典《蜂蜜》和GB 14963-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》規(guī)定：果糖和葡萄糖的總量不得少于60 g/100 g；蔗糖的含量除桉樹(shù)蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜、野桂花蜜不得高于10 g/100 g外，其他蜂蜜不得高于5 g/100 g；麥芽糖含量不高于5 g/100 g。由表2可知，除L17號(hào)樣品外，所有蜂蜜樣品的果糖和葡萄糖含量都在規(guī)定的60 g/100 g以上，蔗糖和麥芽糖的含量均低于5 g/100 g，L17號(hào)樣品果糖和葡萄糖的含量為4.9 g/100 g，麥芽糖含量高達(dá)42.6 g/100 g，判斷該樣品添加了外源性糖漿，主要成分為麥芽糖漿。

按照GB/T 18932.1-2002《蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定方法 穩(wěn)定碳同位素比率法》計(jì)算結(jié)果規(guī)定，當(dāng)計(jì)算結(jié)果≥7%時(shí)，應(yīng)認(rèn)為含有碳-4植物糖。表2中L21、L27、L35、L36、L44號(hào)樣品的計(jì)算結(jié)果大于7%，表明這5個(gè)樣品添加了碳-4植物糖(主要是指玉米糖或甘蔗糖)，L17號(hào)樣品未提取出蛋白，由于真實(shí)蜂蜜樣品中含有蛋白，結(jié)合糖含量的測(cè)定結(jié)果，該蜂蜜樣品為假蜂蜜樣品。

按照本研究建立的方法對(duì)選取的蜂蜜樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在硅膠薄層板上的展開(kāi)結(jié)果見(jiàn)表2，其中L17、L18、L30、L36號(hào)樣品在薄層色譜法中呈陽(yáng)性，表明這些蜂蜜樣品中摻有淀粉轉(zhuǎn)化來(lái)的高果糖淀粉糖漿。

3 結(jié)論與展望

本研究通過(guò)對(duì)GB/T 18932.2-2002標(biāo)準(zhǔn)方法的樣品前處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃層析柱，結(jié)合固相萃取裝置，可以進(jìn)行批量樣品的同時(shí)處理，減少了填料和試劑使用量，縮短了前處理過(guò)程的時(shí)間，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，比較了本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果，譜圖顯示兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明本研究方法可以對(duì)蜂蜜中摻有的高果糖淀粉糖漿進(jìn)行定性判斷，能滿足生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)要求。

隨著蜂蜜中摻入糖漿來(lái)源多樣，以及摻假手段越來(lái)越復(fù)雜，薄層色譜法的應(yīng)用有一定局限性，且很難通過(guò)一種檢測(cè)方法對(duì)蜂蜜的摻假進(jìn)行確證，需要結(jié)合多種檢測(cè)方法來(lái)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)，蜂蜜摻假的檢測(cè)技術(shù)也要隨著摻假手段的變化而不斷發(fā)展。