β-地中海貧血修飾基因研究進展

龍嵐 賀靜

人類β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，5 個功能基因從5'→3'端依次為ε-Gγ-Aγ-δ-β（圖1），其中，ε-基因在胚胎期表達，Gγ 和Aγ-基因在胎兒期表達，δ 和β-基因在出生后表達［1］。在紅系發(fā)育過程中，β-珠蛋白基因的表達經(jīng)歷2 次轉(zhuǎn)換，第一次是胚胎期表達的ε-基因被胎兒期的γ-基因取代；第二次是胎兒期的γ-基因被成人期的β-和δ-基因取代［1］。珠蛋白基因表達轉(zhuǎn)換過程中，都有特異性紅系因子的參與［2］。1975年，Stamatoyannopoulos G報道了同時患有鐮刀型細胞貧血（Sickle cell anae-mia，SCA）和遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增高癥（Hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的黑人患者并沒有表現(xiàn)出貧血的癥狀，這種以前未確定的HPFH 的形式可能解釋了胎兒血紅蛋白（Fetal haemoglobin，Hb F）異常升高的SCA 患者輕度的臨床表現(xiàn)和血紅蛋白表型［3］。這種HPFH 對重型β-地貧患者也有修飾作用［4-5］。β-地中海貧血修飾基因（β-Thalassemia modifier genes）能影響珠蛋白的表達、合成及穩(wěn)定性，導(dǎo)致具有相同致病基因型患者的臨床表型出現(xiàn)差異［6］。研究發(fā)現(xiàn)，中國南方是β-地貧高發(fā)區(qū)［7-8］。本文將對國內(nèi)外影響Hb F表達的修飾基因：Xmn1-HBG2基因、HBS1L-MYB基因、反式作用因子、紅系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和鋅指轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控γ-珠蛋白進行總結(jié)，并對它們調(diào)控γ-珠蛋白表達的機制進行闡述，以期為中國β-地貧患者的γ-基因表達減輕或治愈β-地貧患者癥狀提供參考。

1 Xmn1-HBG2 基因、HBS1L-MYB 基因?qū)Ζ?珠蛋白基因的調(diào)控

1.1 Xmn1-HBG2 基因

Xmn1（C>T）多態(tài)性是HBG2基因中對β-地貧起修飾作用的重要數(shù)量性狀位點（Quantitative trait loci，QTL），研究發(fā)現(xiàn)，HBG2基因-158 位點Xmn1（C>T）的多態(tài)性能明顯提高歐洲、美洲、非洲和亞洲等不同人群中β-地貧患者或SCA 患者的Hb F 的表達水平，減輕β-地貧或SCA 的嚴重程度［5，9-12］。研究人員對該位點的不同基因型進行研究，發(fā)現(xiàn)相比于“CT”和“CC”等位基因型的人群“TT”等位基因型的人群Hb F 有更高表達水平［13-14］。最近研究表明，Xmn1 多態(tài)性的“T”等位基因會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制子與β-LCR 的結(jié)合減弱，引起HBG2基因在成人期持續(xù)表達［14］。進一步研究表明，Xmn1 對β-地貧的修飾作用與位于β-珠蛋白基因位點控制區(qū)（Locus control region，LCR）超敏位點（DNase I-hypersensitive site，HS）（圖1）處的回文位點有關(guān)［15-16］。

圖1 γ-珠蛋白基因調(diào)控示意圖［1］Figure 1 γ-globin gene regulation schematic diagram［1］

1.2 HBS1L-MYB 基因

骨髓母細胞瘤基因（Myeloblastosis oncogene，MYB）編碼一個特異性序列的DNA 結(jié)合蛋白MYB，MYB 是造血和紅細胞生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它對調(diào)節(jié)γ-基因表達起重要作用，是β-地貧的關(guān)鍵修飾因子［17］。研究表明，MYB 可以通過兩種方式抑制γ-珠蛋白基因表達［1，18］。其一，它能直接激活紅系Kruppel 樣因子（Kruppel-like factor 1，KLF1）的表達，通過KLF1 抑制γ-珠蛋白基因的表達。其二，2014年Stadhouders 等［18］發(fā)現(xiàn)該基因間區(qū)域存在紅系轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物結(jié)合的保守核心調(diào)控序列（-87，-84，-71 和-63），它們是紅系轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（LDB-1/NLI，GATA-1，TAL-1 和ETO-2）的主要結(jié)合位點，這些紅系轉(zhuǎn)錄因子能與遠距離的MYB相互作用并調(diào)控MYB表達，通過調(diào)控MYB的表達進一步調(diào)控紅系分化（圖1）。進一步研究表明，HBS1L-MYB基因間的突變減少了紅系轉(zhuǎn)錄因子（LDB-1、GATA-1、TAL-1、ETO-2 以及KLF-1）與該基因的結(jié)合，影響了紅系轉(zhuǎn)錄因子與遠距離增強子MYB基因的相互作用和MYB的表達水平，引起Hb F 表達升高［18］。大多數(shù)報道的HBS1L-MYB基因區(qū)域上引起Hb F 升高的SNP 位點包括rs66650371位點3-bp 缺失，rs9399137，rs4895441 等［19］。

2 反式作用因子對γ-珠蛋白基因的調(diào)控

2.1 BCL11A

B-cell lymphoma/leukemia 11A（BCL11A）是γ-基因的抑制子，由位于染色體2p15-16.1 上的BCL11A基因表達，主要存在于腦和造血組織中；BCL11A基因與Hb F 的表達相關(guān)，在成人紅系祖細胞中BCL11A基因的高表達引起Hb F 表達水平降低，而BCL11A基因的低表達則會引起Hb F 的表達水平升高［20-21］。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，BCL11A 與β-珠蛋白基因中富含G 的GGCCGG 序列特異性結(jié)合，抑制了γ-基因的表達［21］。這種富含G 的GGCC-GG 序列主要存在于LCR 的HS3、δ-珠蛋白基因上游與Hb F 高表達相關(guān)的Corfu 缺失區(qū)域以及Aγ-珠蛋白基因的下游區(qū)域。BCL11A 可通過招募核小體重塑和去乙?；笍?fù)合物（The nucleosome remodeling and deacetylase complex，NuRD）與GATA-1 和FOG-1協(xié)同作用，導(dǎo)致γ-珠蛋白基因沉默。在成人紅系細胞中，BCL11A基因的突變導(dǎo)致了BCL11A 表達下調(diào)可以重新激活γ-基因表達，升高Hb F 水平［21-22］。BCL11A基因間引起Hb F 升高的SNP 位點包括rs766432、rs4671393 和rs11886868 等［23］。

2.2 KLF1

KLF1 是紅系分化過程中重要的調(diào)控因子，通過多種機制調(diào)控紅系分化。KLF1 是由位于染色體19p13.2 上全長約3kb 的含有三個外顯子的KLF1基因編碼的包含362 個氨基酸的含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，其功能結(jié)構(gòu)域有兩個：一個是羧基末端結(jié)構(gòu)域，另一個是富含脯氨酸的氨基末端激活結(jié)構(gòu)域［24］。KLF1 與β-珠蛋白基因啟動子區(qū)域的CACCC 盒結(jié)合，促進了LCR 區(qū)的HS3 位點與β-基因啟動子區(qū)域結(jié)合，進一步激活β-珠蛋白的表達［25］。KLF1 也能直接調(diào)控BCL11A 表達，在人臍帶血來源的紅系祖細胞-2（Human umbilical cord blood derived erythoid progenitor-2，HUDEP-2）中，敲除KLF1基因的增強子HS1 能夠引起KLF1 和BCL11A 的表達同時降低，從而開放γ-基因表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)BCL11A基因啟動子的-371 位點存在保守的KLF1 的結(jié)合位點CACCC 盒，表明KLF1 在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)BCL11A 的表達［26］。KLF1基因的一些良性突變引起的HPFH 對重型β-地貧患者起到修飾作用，中國人群KLF1基因的c.525_526insCGGCGCC、c.892G>C 和c.1012C>T 突變引起Hb F 水平升高［27］。

2.3 ZBTB7A

Zinc finger and BTB domain containing 7A（ZBTB7A）或 稱The lymphoma/leukemia related factor（LRF）是Gγ-基因的抑制子，是由ZBTB7A基因編碼的Krüppel 家族的鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子［28，30］。研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB7A 和BCL11A 分別結(jié)合在Gγ-基因的-200 和-115 位點，抑制Gγ-基因表達；這些結(jié)合位點的點突變導(dǎo)致ZBTB7A 和BCL11A 與Gγ-基因-200 和-115 位點的結(jié)合減弱，引起Gγ-基因開放表達［28，30］。ZBTB7A基因的啟動子區(qū)包含保守的CACCC 盒，在HUDEP-2 中，KLF1 與ZBTB7A的啟動子區(qū)CACCC 盒結(jié)合直接激活ZBTB7A表達ZBTB7A 蛋白，并通過ZBTB7A 調(diào)控紅系分化。ZBTB7A啟動子區(qū)KLF1 的結(jié)合位點突變會導(dǎo)致KLF1 結(jié)合減弱，γ-珠蛋白基因開放表達［29-30］。

3 紅系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對γ-珠蛋白基因的調(diào)控

1988年，Evans 等［31］發(fā)現(xiàn)了第一個紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1，它通過識別并結(jié)合珠蛋白基因簇上的GATA 盒，調(diào)控紅系分化。從胚胎發(fā)育的第5 天起，在每個階段的紅系細胞中都包含某種活性因子，即紅細胞特異性因子（The erythroid-spe-cific factor，Eryfl），Eryfl 是紅細胞特有的，在其他類型的細胞中，這種Eryfl 不存在或者其活性受到抑制［31］。

3.1 NF-E4

NF-E4 是紅系分化的重要調(diào)控因子，對調(diào)控β-珠蛋白基因簇上的基因表達起重要作用。1988年，Choi OR 和Engel JD［32］首次提出珠蛋白基因之間競爭單一調(diào)控序列（即啟動子競爭），它是一種珠蛋白時序性表達的調(diào)控機制，啟動子競爭表明，階段選擇性元件（Stage selector element，SSE）是β-珠蛋白基因簇上的每個獨立的基因優(yōu)先表達所必須的一個元件。在胎兒紅系細胞中，NF-E4 與CP2 形成階段選擇性蛋白（Stage selector protein，SSP）復(fù)合物，然后SSP 結(jié)合到γ-基因的SSE 上并形成SSP-SSE 復(fù)合物，調(diào)控γ-基因表達［33-34］。在成人紅細胞生成過程中，SSP 復(fù)合物與β-基因的啟動子中的SSE 結(jié)合，使得β-基因與LCR 相互作用引起β-珠蛋白表達［33］。在成人紅細胞中，SSP 復(fù)合物結(jié)合在γ-基因啟動子-202（C→G）的突變位點上，引起HPFH，對β-地貧患者起修飾作用［35］。研究證明了由NF-E4 組成的SSP 復(fù)合物的結(jié)合位點是絕對保守的，這些位點包括ε-啟動子、HS2 和HS3 等［33］。

3.2 CTDSPL2

CTD 小磷酸酶樣2 蛋白（CTDSPL2）由RNA聚合酶II C-末端結(jié)構(gòu)域磷酸酶2（RNA polymerase II c-terminal domain small phosphatase like 2，CTD-SPL2）基因表達，它在K562 細胞和臍帶血來源的CD34+細胞中高表達［36］。研究認為，該蛋白一方面可能與一些重要的珠蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如EKLF，F(xiàn)KLF 和NF-E4 等相互作用而被招募到ε-和γ-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中，促進紅系細胞的紅系分化（圖1）［36］；另一方面，CTDSPL2 是一個新出現(xiàn)的磷酸酶家族，它的亞家族包括小CTD 磷酸酶（Small CTD phosphatases，SCPs），CTDSPL2 可能調(diào)節(jié)珠蛋白基因表達中關(guān)鍵因子的磷酸化狀態(tài)，促進紅系細胞的紅系分化，這些結(jié)論還需進一步深入研究［37］。

3.3 NuRD 復(fù)合物

NuRD 是分子量為1MDa 的多亞基蛋白復(fù)合物，包括CHD4（Mi2β），MTA1/2/3，p66β（GATAD2b），p66α（GATAD2a），HDAC1/2 和MBD3［21，38］。研究發(fā)現(xiàn)，NuRD 在調(diào)控γ-珠蛋白表達中扮演重要角色，GATA1-FOG1-Mi2-NuRD 復(fù)合物結(jié)合在-566 的GATA 位點導(dǎo)致Aγ-基因的沉默；MBD3-NuRD 可以直接和GATA1-FOG1 結(jié)合，形成GATAl-FOGl-MBD3-NuRD 復(fù)合物并通過GATA1 直接結(jié)合在γ-基因啟動子區(qū)來抑制γ-基因的表達［39］。MBD2-NuRD 以間接方式使γ-基因啟動子區(qū)高度甲基化，抑制γ-基因的表達［40］。CHD4（Mi2β）-NuRD 則直接與KLF-1和BCL11A的啟動子區(qū)結(jié)合，正向調(diào)控這兩個轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控γ-基因表達，而GATAD2A 抑制γ-基因表達的機制主要有兩種：首先它能直接和MYB啟動子區(qū)結(jié)合來正向調(diào)控MYB表達，從而抑制γ-基因表達；其次它與TGATAA 序列結(jié)合，直接抑制γ-基因表達［41］。

4 鋅指轉(zhuǎn)錄因子對γ-珠蛋白基因的調(diào)控

4.1 LYAR

Ly-1 antibody reactive clone（LYAR）是具有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在K562 細胞以及人類紅系祖細胞中，LYAR 與γ-基因5′-非翻譯區(qū)（5′-Untranslated region，5′-UTR）的+26 或+32 GGTTAT 序列結(jié)合，與組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5 相互作用，引起組蛋白H4 精氨酸3 的對稱甲基化（Symmetric methylation of histone H4 Argi-nine 3，H4R3me2s），調(diào)控γ-基因的表達（圖1）［22］。研究發(fā)現(xiàn)Aγ-基因（HBG1）5′UTR 上+25 處的rs368698783 位點突變率相當(dāng)高，它處于γ-基因抑制因子LYAR 結(jié)合序列GGTTAT 上，并與Gγ-158（XmnI）多態(tài)性幾乎完全連鎖，Aγ+25 突變會使LYAR 結(jié)合程度減弱，導(dǎo)致在紅系壓力下開放γ-基因表達［42］。

4.2 GATA-1

GATA-1 由位于X 染色體上的GATA基因表達，它通過識別珠蛋白基因簇上的GATA 盒并與其結(jié)合，以多種方式調(diào)控珠蛋白基因表達［43］。在人成熟紅細胞生成過程中，GATA1、FOG1 和Mi2形成GATA1/FOG1/Mi2 復(fù)合物然后結(jié)合到γ-基因近端啟動子-566/-567 的GATA 基序位點，部分參與沉默γ-基因（圖1）［44］。在紅系細胞中的β-基因HSSs 位點，尤其是在HS2 核心區(qū)域，發(fā)現(xiàn)一個復(fù)合物E 盒/GATA復(fù)合物，由GATA-1/LMO-2/TAL-1/LDB-1 組成，其中LDB-1/NLI 的N-端保守的自交互結(jié)構(gòu)域直接與GATA-1 相互作用，而保守的C-端LIM 結(jié)構(gòu)域和LIM 蛋白（LMO2）相互作用，然后結(jié)合SCL 組成新的復(fù)合物L(fēng)DB-1/GATA-1/SCL/LMO2［45］。在GATA1 的作用下，LDB-1/GATA-1/SCL/LMO2 結(jié)合到β-基因的HS2 上形成染色質(zhì)環(huán)調(diào)控γ-基因沉默，此復(fù)合物的高表達對調(diào)控紅系分化是必要的［45］。GATA1 還和NF-E2 蛋白協(xié)同激活LCRs，LCR 是強大的遠距離增強子，在紅細胞生長發(fā)育過程中以適當(dāng)?shù)姆绞秸{(diào)控珠蛋白基因簇轉(zhuǎn)錄［45］。

5 小結(jié)與展望

β-地貧修飾基因是目前研究β-地貧基因治療的熱點，它通過調(diào)控珠蛋白的表達，影響β-地貧的癥狀。其中最為常見的修飾基因有Xmn1-HBG2基因、HBS1L-MYB基因、反式作用因子、紅系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和鋅指轉(zhuǎn)錄因子等，它們都能調(diào)控珠蛋白的表達，但是調(diào)控方式卻不盡相同，作用機制也尚不完全清楚。是否還有其他的修飾基因通過另外的調(diào)控方式和作用機制影響珠蛋白表達水平，這就需要科研人員進一步對β-地貧開展大樣本量的遺傳學(xué)分析和機制研究，以期發(fā)現(xiàn)新的修飾基因并闡明新的作用機制，并為β-地貧的臨床用藥、基因治療和個體化醫(yī)療提供指導(dǎo)。