前列腺癌中CD147、MMP-2 mRNA表達(dá)與臨床分期、病理學(xué)分級(jí)的關(guān)系

吳狄 鄧海媚 姚睿智 陳銘

前列腺癌（prostate cancer，PCA）為前列腺泡細(xì)胞異常無序生長(zhǎng)而產(chǎn)生的惡性腫瘤，其在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居第二位，死亡率位居第六位［1］。近年來我國(guó)前列腺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)［2］，如何提高其早期診斷水平是目前研究熱點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)失控及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移為一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過程，而細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloprotein-ase inducer，EMMPRIN）又稱為CD147，作為一種重要的跨膜糖蛋白，CD147 在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮著重要作用。其在多種腫瘤細(xì)胞中均有不同程度表達(dá)，可能與其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)有密切關(guān)系，是目前腫瘤研究的新興熱點(diǎn)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）屬于明膠酶，為基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，可特異性破壞基底膜，同腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，對(duì)判斷疾病病情進(jìn)展有指導(dǎo)意義［4］。但目前關(guān)于CD147、MMP-2 在前列腺癌中的表達(dá)現(xiàn)狀研究較少。本文將評(píng)估CD147、MMP-2 在前列腺癌中的臨床意義，旨在為臨床準(zhǔn)確診斷前列腺癌提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月至2018年12月本院收治的前列腺癌患者58 例及同期行手術(shù)治療的前列腺增生患者50 例為研究對(duì)象。前列腺癌納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合前列腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，且在術(shù)前未接受內(nèi)分泌治療或放化療；②入院時(shí)Gleason 評(píng)分在2 分及以上，TNM 分期T1～4 期；③知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型惡性腫瘤患者；②病歷資料不全；③配合依從性差者。58 例前列腺癌：年齡平均（60.15±6.18）歲；臨床分期：T1～T2 期31例，T3～T4 期27 例；病理學(xué)分級(jí)2～4 級(jí)31 例，≥5 級(jí)27 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 期30 例，N1 期28 例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0 期30 例，M1 期28 例。另選擇同期行前列腺摘除術(shù)與經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的良性前列腺增生患者50 例，年齡平均（60.11±6.24）歲，均知情同意本研究。本研究獲得院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

術(shù)中收集前列腺癌患者的病灶組織、癌旁組織及前列腺增生患者的組織標(biāo)本。將所有前列腺組織以石蠟包埋，每張切片0.5 μm，連續(xù)切片5張，壓片烘干后標(biāo)記上病例編號(hào)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

CD147mRNA 原位雜交試劑盒與地高辛標(biāo)記的CD147 相關(guān)寡核苷酸探針均購(gòu)自武漢博士德公司；MMP-2mRNA PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。

1.2.3 檢測(cè)方法

CD147mRNA 以焦炭酸二乙酯（DEPC）清洗原位雜交試驗(yàn)中的器皿、蒸餾水。陰性對(duì)照組中只加雜交液，不加探針。檢測(cè)步驟：將石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化，應(yīng)用3%H2O2將過氧化物滅活，以蛋白酶K 進(jìn)行消化處理，暴露mRNA 的核酸片段，以預(yù)雜交封閉片段上非特異性雜交點(diǎn)，后進(jìn)行二次雜交，以地高辛標(biāo)記的CD147 探針處理。雜交后，去除非堿基配對(duì)RNA，以抗體連接，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，常規(guī)采用蘇木精復(fù)染，后脫水，透明，封片。MMP-2mRNA：依據(jù)試劑盒說明書提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將cDNA 擴(kuò)增為MMP-2，以β-actin 為內(nèi)參，PCR 反應(yīng)條件：95℃30 s，循環(huán)42 次；95℃5 s，循環(huán)42 次；60℃，45 s，循環(huán)42 次。以-2△△CT法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)測(cè)定3 次后取平均值。

1.2.4 病理結(jié)果的判讀

由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)判，細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色或棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，以半定量積分法［6］對(duì)原位雜交結(jié)果進(jìn)行判斷，其中染色強(qiáng)度為淺黃色記1 分，深黃色記2 分，棕黃色記3分，隨機(jī)找到5 個(gè)400 倍的視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞在視野范圍內(nèi)占比，陽(yáng)性細(xì)胞率<5%記1分，陽(yáng)性細(xì)胞率在5%～25%記2 分，陽(yáng)性細(xì)胞率在26%～50%記3 分，陽(yáng)性細(xì)胞率>50%記4 分。以上述兩部分分值之和作為最終總分，總分1～3 分為陰性（-），4～6 分為陽(yáng)性（+），7 分為強(qiáng)陽(yáng)性（++），陽(yáng)性率=（陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性）/總例數(shù)×100%。如圖1。

圖1 病理結(jié)果判讀（SP，×400）Figure 1 Interpretation of pathological results（SP，×400）

1.2.5 資料搜集

搜集前列腺癌患者的臨床資料，包括年齡、臨床分期、病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，分析前列腺癌患者病灶組織中CD147、MMP-2mRNA 表達(dá)水平與各參數(shù)的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中CD147、MMP-2mRNA表達(dá)水平比較

前列腺癌病灶組織中CD147mRNA 陽(yáng)性率及MMP-2mRNA 表達(dá)水平高于前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織（Z值=16.207，t配對(duì)=17.771，P<0.05），前列腺癌癌旁組織CD147mRNA 陽(yáng)性率及MMP-2mRNA 表達(dá)水平也高于前列腺增生組織（χ2=4.776，t獨(dú)立=23.193，P<0.05）。見表1。

表1 不同組織中CD147、MMP-2 mRNA 表達(dá)水平比較［n（%）］Table 1 Comparison of CD147 and MMP-2 expression levels in different tissues［n（%）］

2.2 CD147、MMP-2 mRNA表達(dá)水平與各參數(shù)的關(guān)系

前列腺癌患者臨床分期T3～T4期、病理學(xué)分級(jí)≥5級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1 期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1 期者的CD147mRNA 陽(yáng)性率及MMP-2 表達(dá)水平高于臨床分期T1～T2期、病理學(xué)分級(jí)2～4級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0期者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 CD147 mRNA、MMP-2 mRNA 表達(dá)水平與各參數(shù)的關(guān)系［n（%）］Table 2 Relationship between CD147 mRNA，MMP-2 mRNA and various parameters［n（%）］

2.3 電泳結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，前列腺癌病灶組織中CD147mRNA、MMP-2mRNA 表達(dá)水平較前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織高。見圖2。

圖2 電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoresis results

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多個(gè)基因協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，其主要含原癌基因的表達(dá)上調(diào)及抑癌基因的表達(dá)下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌的發(fā)生可能與遺傳、環(huán)境、性激素、基因調(diào)控異常等有關(guān)，其中基因異常在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織、遠(yuǎn)處器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［7］。本研究結(jié)果與鄒桂成等［8］的報(bào)道結(jié)果（前列腺癌癌組織、前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織CD147 mRNA 陽(yáng)性率分別為95.08%、32.79%、16.32%）一致，表明CD147 在前列腺癌患者病灶組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。正常組織上皮細(xì)胞由一層基底膜及軀體其他部位隔離開，正常細(xì)胞無法突破這一層基底膜屏障，而腫瘤細(xì)胞經(jīng)刺激基質(zhì)細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可破壞基底膜屏障。在前列腺患者中隨病理分級(jí)增加，其惡性程度升高，而基底膜缺失也越大，當(dāng)腫瘤增大到一定程度時(shí)，獲得生成血管能力，這為前列腺上皮肉瘤演變?yōu)榻?rùn)性腫瘤提供了良好條件。CD147 作為一種細(xì)胞外基質(zhì)類金屬蛋白酶型誘導(dǎo)分子，可刺激前列腺癌患者外周間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其生成MMPs，繼而使前列腺癌病灶組織中MMPs 水平升高，活性增強(qiáng)，有利于降解細(xì)胞外部基底膜與間質(zhì)等成分，促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展［9］。Liang 等［10］的研究也發(fā)現(xiàn)，CD147 的DNA 啟動(dòng)子低甲基化可能是與癌癥相關(guān)的CD147 過度表達(dá)相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制之一，并可能在前列腺癌發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。但本研究前列腺癌病灶組織中CD147 mRNA 陽(yáng)性率較鄒桂成報(bào)道的略低，可能因患者配合度差或所采用的檢測(cè)方法靈敏度不一等因素有關(guān)，因此原位雜交法檢測(cè)CD147 mRNA 的靈敏度仍有待提高。此外本研究結(jié)果說明在前列腺癌中MMP-2 表達(dá)水平上升，MMP-2 可能在酶解基底膜與細(xì)胞間基質(zhì)成分中起著“鉆頭”作用，因此也與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。

本研究也發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者中，臨床分期T3～T4 期、病理學(xué)分級(jí)≥5 級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1 期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1 期的CD147 mRNA 陽(yáng)性率及MMP-2 表達(dá)水平較臨床分期T1～T2 期、病理學(xué)分級(jí)2～4 級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0 期者高，與既往研究［12-13］一致，說明前列腺癌患者病灶組織中CD147、MMP-2mRNA 的表達(dá)水平與臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。此外CD147 也能與MMP-2 等形成復(fù)合物，而粘附到腫瘤細(xì)胞表面，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜的降解，增加腫瘤細(xì)胞侵襲力，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子生成，介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程［14-15］。

綜上所述，檢測(cè)前列腺癌患者病灶組織CD147、MMP-2 mRNA 有助于推斷其臨床分期、病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況，值得在臨床推廣實(shí)踐。