MGMT、h MLH1基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)常見藥物化療敏感性的影響研究

王傳璽 梅潔 閆兆月 張鳳平 段冉 丁艮曉

人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤［又簡(jiǎn)稱“腦膠質(zhì)瘤”（glio-ma），后文均用簡(jiǎn)稱］在所有顱內(nèi)病變、顱內(nèi)惡性腫瘤中占比約為45%、80%［1］。洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺等一線化療藥物在臨床腦膠質(zhì)瘤治療中幾乎必不可少，具有生物利用度較高、易透過血腦屏障、毒副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢(shì)。然而實(shí)際臨床中部分患者化療療效難以盡如人意，孫琳［2］等研究顯示腦膠質(zhì)瘤患者經(jīng)替莫唑胺化療藥物獲得有效率僅為34%，重要影響因素即化療藥物耐藥。腦膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)前認(rèn)為可能與多種基因有關(guān)，進(jìn)一步探索腫瘤組織中相關(guān)耐藥基因表達(dá)水平對(duì)腫瘤惡性程度判斷、化療敏感性評(píng)價(jià)及指導(dǎo)針對(duì)性治療有一定現(xiàn)實(shí)意義。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase，MGMT）、錯(cuò)配修復(fù)基因（Human mutl homolog 1，h MLH1）近年來因已被證實(shí)與胃腸道腫瘤、肺癌、乳腺癌等化療耐藥有關(guān)而引起了臨床學(xué)者廣泛重視［3-5］。本研究旨在分析這兩者基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)常見藥物化療敏感性的影響。

1 標(biāo)本與方法

1.1 標(biāo)本來源

于2017年6月至2020年10月，收集本院行開顱手術(shù)切除的80 例膠質(zhì)瘤石蠟切片標(biāo)本，對(duì)應(yīng)患者術(shù)后經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)獲得膠質(zhì)瘤明確診斷［6］；≥18 歲；術(shù)前未接受化療等其他相關(guān)治療；標(biāo)本對(duì)應(yīng)病例資料信息完善。男女比例為3∶2；平均年齡（47.55±10.71）歲；病理類型含有39 例（48.75%）星形細(xì)胞瘤、19 例（23.75%）室管膜瘤、15例（18.75%）少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤與7 例（8.75%）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；世界衛(wèi)生組織膠質(zhì)瘤病理分級(jí)［7］含有25 例（31.25%）為Ⅱ級(jí)、35 例（43.75%）為Ⅲ級(jí)、20例（25.00%）為Ⅳ級(jí)。同一時(shí)期抽取40 例患者經(jīng)腦外傷減壓切除的腦組織切片標(biāo)本，明確為正常腦組織，男女比例為3∶2；平均年齡（49.07±11.60）歲，與腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本對(duì)應(yīng)患者的性別比例、年齡相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有患者及家屬均知情同意。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 MGMT 與h MLH1 蛋白免疫組化檢測(cè)

腦膠質(zhì)瘤、正常腦組織標(biāo)本蠟塊進(jìn)行修整后，調(diào)整位置連續(xù)切割3～4 μm 切片，放載玻片烘烤、100%乙醇中脫水后梯度水化，沖洗后放于含抗原修復(fù)液的高壓鍋中持續(xù)加熱，之后于室溫冷卻完成抗原修復(fù)。隨后室溫下封閉孵育，PBS 反復(fù)洗滌后即可加入對(duì)應(yīng)抗體（一抗，其中鼠抗人MGMT抗體、兔抗人h MLH1 抗體均購買于美國Abcam公司），4℃冰箱過夜孵育后予以PBS 液再次反復(fù)沖洗后即可給予二抗，之后室溫繼續(xù)孵育，PBS 液反復(fù)沖洗后依次完成DAB 與H2O2顯色液配制、復(fù)染、二甲苯浸泡透明、中性樹脂封片、光學(xué)顯微鏡下閱片等操作。

1.2.2 結(jié)果判讀［8］

隨機(jī)擇取5 個(gè)高倍顯微鏡（400×）視野，觀察陽性細(xì)胞對(duì)應(yīng)染色強(qiáng)度及所占百分比，基于二者的乘積完成最終評(píng)分；陽性細(xì)胞無著色、著淺黃色、著棕黃色、著棕褐色依次記為0 分、1 分、2 分、3 分，陽性細(xì)胞所占百分比<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%及≥75%依次記為0分、1 分、2 分、3 分、4 分；最終評(píng)分0 分為陰性（-），1～4、5～8、9～12 分均視為為陽性，分別為（+）、（++）及（+++）。

1.2.3 敏感性試驗(yàn)

標(biāo)本除菌洗滌液：含雙抗的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，青霉素與鏈霉索濃度為100 μ/mL；組織培養(yǎng)液：含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，噻唑藍(lán)溶液濃度為10 mg/mL，通過生理鹽水配制及除菌處理后備用，4 攝氏度環(huán)境避光保存?；熕幬锛捌鋵?duì)應(yīng)濃度：洛莫司汀、福莫司汀均為10 μg/mL，替尼泊苷20 pμg/mL，尼莫司汀6.5 pug/mL 及替莫唑胺7 μg/mL。所用藥物濃度均參考說明書所給血漿峰濃度，選用滅菌注射用水作為配藥溶劑。組織培養(yǎng)藥敏采用組織塊培養(yǎng)-終點(diǎn)染色-計(jì)算機(jī)分析法（tissue culture-end point staining com-puter image analysis，TECIA），組織培養(yǎng)為四孔同步法，可保證組織塊存活及培養(yǎng)成功，即四孔培養(yǎng)基中平均有3 孔以上存活。參照文獻(xiàn)［9］方法計(jì)算化療藥物抑制率（IR），藥物敏感性以IR 作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，IR>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，<30%為耐藥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）描述，行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腦組織MGMT 與h MLH1 基因表達(dá)情況

腦膠質(zhì)瘤、正常腦組織中MGMT 與h MLH1基因表達(dá)程度差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。MGMT 與h MLH1 均在細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆?；蜿栃燥@色彌散分布。見圖1。

表1 MGMT、h MLH1 表達(dá)比較［n（%）］Table 1 expression comparison of MGMT and h-mlh1［n（%）］

圖1 MGMT、h MLH1 基因在腦膠質(zhì)瘤、正常腦組織中表達(dá)（SP，×400）Figure 1 expression of MGMT and H MLH1 genes in glioma and normal brain tissues（SP，×400）

2.2 不同病理類型、分級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織MGMT 與h MLH1 基因表達(dá)情況

不同病理類型腦膠質(zhì)瘤組織腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 與h MLH1 基因陽性表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而病理分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 與h MLH1 基因陽性表達(dá)率依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同病理、分級(jí)類型腦膠質(zhì)瘤組織MGMT 與h MLH1 基因表達(dá)比較［n（%）］Table 2 Comparison of MGMT and hMLH1 gene expression in different pathological and grading types of gliomas［n（%）］

2.3 化療敏感性與病理特征及MGMT、h MLH1基因免疫組化因子表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系

莫司汀、替尼泊苷、替莫唑胺敏感率與病理分級(jí)有關(guān)（P<0.05），MGMT、h MLH1 陽性表達(dá)洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺敏感率均明顯低于陰性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 化療敏感性與病理特征及MGMT、h MLH1 基因表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系［n（%）］Table 3 The relationship between chemosensitivity and pathological features and the expression of MGMT and hMLH1 genes［n（%）］

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)MGMT、h MLH1 兩種基因在對(duì)應(yīng)腦組織標(biāo)本中均在細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆?；蜿栃燥@色彌散分布，而且MGMT 和h MLH1 基因在人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中陽性表達(dá)率高，與Deimling［9］等及李孟凱［10］等早期報(bào)道結(jié)果一致；同時(shí)，MGMT 和h MLH1 基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理類型無關(guān)，與疾病進(jìn)展有一定關(guān)聯(lián)。其中MGMT 作為一種DNA修復(fù)酶，具有修復(fù)經(jīng)亞硝脲類化療藥物引起的DNA 烷基化損害作用，可直接影響腦膠質(zhì)瘤化療效果甚至促使化療失敗，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。Wen［11］等報(bào)道證實(shí)腦膠質(zhì)瘤組織MGMT 基因表達(dá)異常升高，且與病理分級(jí)及預(yù)后密切相關(guān)。事實(shí)上，h MLH1 基因?yàn)閔 MLH 中重要的一員，在DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷中扮演了舉足輕重的角色，被視為包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的診斷特異性指標(biāo)，王磊［12］等報(bào)道即曾證實(shí)h MLH1 基因表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。

本研究中除了病理分級(jí)可影響人腦膠質(zhì)瘤部分藥物化療敏感性以外，MGMT 和h MLH1 基因可影響多種藥物化療敏感性，包括洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺，即MGMT、h MLH1 表達(dá)程度與化療敏性密切相關(guān)。由于MGMT 能夠修復(fù)以烷化劑為代表的抗腫瘤藥物引起的細(xì)胞損傷，因此可通過腫瘤組織中表達(dá)水平反映對(duì)烷化劑如洛莫司汀、替莫唑胺等的敏感性［13］。Holmes［14］等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MGMT 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑抗癌藥耐藥性比低表達(dá)更顯著，認(rèn)為下調(diào)表達(dá)陽性或高表達(dá)膠質(zhì)瘤中MGMT 表達(dá)對(duì)于提高替莫唑胺等一線藥物化療效果有助益。需指出的是，堿基錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)與MCMT 被視為腦膠質(zhì)瘤一線藥物產(chǎn)生耐藥的最重要的兩個(gè)因素，其中前者作為修復(fù)DNA 堿基錯(cuò)配的安全保障體系，包括多個(gè)hMLH 基因，均能夠識(shí)別并清楚錯(cuò)誤或異常配對(duì)的胸腺嘧啶，倘若該體系甲基化或突變，極易導(dǎo)致DNA 錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，繼而影響藥物敏感性，而h MLH1 正是錯(cuò)配修復(fù)基因最重要成員之一，極易發(fā)生甲基化，并引發(fā)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)失活［15］。劉容容［16］等證實(shí)了h MLH1 基因陽性表達(dá)可影響替莫唑胺化療敏感性，也認(rèn)為可能機(jī)制為h MLH1 基因啟動(dòng)子甲基化增強(qiáng)。上述均說明MGMT、h MLH1 基因與腦膠質(zhì)瘤治療過程藥物敏感性有關(guān)，支持了本研究結(jié)論，故推測(cè)以上兩個(gè)基因?qū)Ω纳颇X膠質(zhì)瘤化療耐藥性有一定指導(dǎo)作用，即通過降低MGMT、hMLH 表達(dá)可能能夠降低惡性腦膠質(zhì)瘤對(duì)相關(guān)藥物的耐藥性，增強(qiáng)化療敏感性，但其具體實(shí)踐效果有待研究證實(shí)。此外，MGMT 和h MLH1 基因影響多種化療藥物敏感性的原因還可能為二者均參與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，但其具體機(jī)制有待后續(xù)研究論證。