SPAG9 mRNA、Livin mRNA、Caspase-9 mRNA在曼月樂環(huán)療程中動態(tài)變化及意義

王學(xué)博 李松 任紅娟 楊然 孫麗 薛國勇 瞿小玲

近年來曼月樂環(huán)成為子宮內(nèi)膜非典型增生（endometrial atypical hyperplasia，EAH）及早期子宮內(nèi)膜癌（early endometriod adenoncarcinoma，EEC）的重要保守治療方法，可保留患者生育功能，但不同個體治療反應(yīng)性差異較大，早期預(yù)測曼月樂環(huán)的療效，對指導(dǎo)臨床選取合適療法意義重大［1］。精子相關(guān)抗原9（Sperm associated antigen 9，SPAG9）是c-Jun 氨基末端激酶相互作用家族的一個新成員，靶向SPAG9，抑制SPAG9 信號通路，可阻斷子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中17β 雌二醇誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的惡性行為［2-3］。凋亡蛋白抑制因子（Livin）在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著升高，并與肌層浸潤深度有關(guān)［4］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［5-6］。本研究探討SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA在曼月樂環(huán)療程中動態(tài)變化及意義，旨在為臨床決策提供參考，報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2020年5月本院收治的126 例子宮內(nèi)膜增生類病變患者患者，其中EAH 13例，EEC 113 例。根據(jù)治療后6 個月病理結(jié)果分為緩解組（n=101）、非緩解組（n=25）。①納入標(biāo)準(zhǔn)：符合EAH、EEC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；均有保留生育功能訴求或拒絕手術(shù)要求先保守治療者；入組前未接受過相關(guān)治療。②排除標(biāo)準(zhǔn)：已知或懷疑妊娠，未確診的陰道出血；子宮肌瘤者；子宮息肉者；血液系統(tǒng)疾病者；急性感染類疾病者；有節(jié)育環(huán)過敏史者；宮腔深度>10 cm 者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者及家屬充分知情，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法與療效評定

患者均在宮內(nèi)放置左炔諾孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)（含左炔諾孕酮52 mg/個（20 微克/24 小時），Bayer Yakuhin，Ltd，批準(zhǔn)文號H20140237），于治療前、治療后3、6 個月行婦科超聲檢查測量子宮內(nèi)膜厚度，并按照月經(jīng)失血圖（Pictorial Blood Loss Assess-ment Chart，PBAC）評分評估患者月經(jīng)量，PBAC>100 分為月經(jīng)過多，分值越高，月經(jīng)量越多［8］。同時于治療后6 個月行子宮內(nèi)膜組織活檢，緩解：病變完全消失，無EAH、EEC 的組織病理學(xué)證據(jù)；非緩解：與緩解標(biāo)準(zhǔn)不相符者［9］。

1.2.2SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 檢測

治療前、治療后3、6 個月，采用實時熒光定量PCR 法檢測子宮內(nèi)膜組織SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 表達(dá)，檢測基因相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組基線資料。②比較兩組治療前、治療后3 個月、治療后6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 動態(tài)變化。③比較兩組治療前、治療后3 個月、治療后6 個月PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度。④分析SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 與PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度相關(guān)性。⑤分析曼月樂環(huán)療效的相關(guān)影響因素。⑥分析治療后3 個月、治療后6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA預(yù)測緩解的價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗，組內(nèi)比較行配對t檢驗，計數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗，采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析，Logistic 回歸方程行多因素分析，采用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic，ROC）及ROC 下面積（Area under the curve，AUC）分析各指標(biāo)預(yù)測緩解的價值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料

兩組年齡、疾病類型、體質(zhì)量指數(shù)、疾病類型、婚姻狀態(tài)、生育史、既往史比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料對比［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組基線資料對比［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［n（%），（±s）］

資料年齡（歲）疾病類型EAH EEC體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）偏瘦正常超重肥胖疾病類型EAH EEC婚姻狀態(tài)已婚未婚生育史緩解組（n=101）31.97±6.85非緩解組（n=25）33.58±8.02 t/χ2值1.016 P 值0.312 12（11.88）89（88.12）1（4.00）24（96.00）0.628 0.428 20（19.80）42（41.58）25（24.75）14（13.86）2（8.00）14（56.00）4（16.00）5（20.00）3.703 0.295 62（61.39）39（38.61）10（40.00）15（60.00）3.743 0.053 47（46.53）54（53.47）8（32.00）17（68.00）1.721 0.190無有69（68.32）32（31.68）20（80.00）5（20.00）1.319 0.251既往史總膽固醇異常低密度脂蛋白異常高密度脂蛋白異常三酰甘油異常糖尿病冠心病高血壓18（17.82）13（12.87）9（8.91）14（13.86）8（7.92）2（1.98）1（0.99）7（28.00）1（4.00）5（20.00）6（24.00）4（16.00）0（0）2（8.00）0.744 0.825 1.499 0.877 0.725 0.034 1.758 0.388 0.364 0.221 0.349 0.394 0.854 0.185

2.2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA動態(tài)變化

緩解組治療后3、6 個月SPAG9、LivinmRNA低于非緩解組，Caspase-9mRNA 高于非緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 動態(tài)變化（±s）Table 2 The dynamic changes of SPAG9，Livin and Caspase-9 mRNA between 2 groups（±s）

表2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 動態(tài)變化（±s）Table 2 The dynamic changes of SPAG9，Livin and Caspase-9 mRNA between 2 groups（±s）

注：與本組治療前比較，aP<0.05。

組別緩解組非緩解組t 值P 值例數(shù)101 25 SPAG9 mRNA Livin mRNA Caspase-9 mRNA治療前0.39±0.16 0.42±0.18 0.819 0.415治療后3 個月0.21±0.10a 0.40±0.14 7.811<0.001治療后6 個月0.15±0.05a 0.43±0.13 17.238<0.001治療前8.15±2.65 7.96±2.31 0.357 0.722治療后3 個月6.04±1.97a 8.11±2.59 4.404<0.001治療后6 個月5.14±1.69a 8.20±2.67 7.138<0.001治療前0.38±0.13 0.41±0.15 1.001 0.319治療后3 個月0.56±0.15a 0.42±0.14 4.231<0.001治療后6 個月0.69±0.21a 0.40±0.13 6.588<0.001

2.3 兩組PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度比較

緩解組治療后3、6 個月PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度較非緩解組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 兩組PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度比較（±s）Table 3 Comparison of PBAC score and endometrial thickness between 2 groups（±s）

表3 兩組PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度比較（±s）Table 3 Comparison of PBAC score and endometrial thickness between 2 groups（±s）

組別緩解組非緩解組t 值P 值例數(shù)101 25 PBAC 評分（分）子宮內(nèi)膜厚度（mm）治療前192.56±30.14 189.67±34.28 0.418 0.677治療后3 個月81.66±15.08 105.45±20.63 6.533<0.001治療后6 個月34.48±7.29 91.59±30.05 17.330<0.001治療前12.51±2.09 11.87±2.25 1.350 0.179治療后3 個月5.59±0.92 8.26±2.34 9.055<0.001治療后6 個月4.08±0.74 7.55±2.18 13.313<0.001

2.4 SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 與PBAC 評分、子宮內(nèi)膜厚度關(guān)系

治療后3、6 個月SPAG9mRNA（r=0.369、0.385，P均<0.001）、LivinmRNA（r=0.497、0.566，P均<0.001）與PBAC 評分呈正相關(guān)，治療后3、6 個月SPAG9mRNA（r=0.401、0.427，P均<0.001）、Liv-inmRNA（r=0.428、0.519，P均<0.001）與子宮內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)；治療后3、6 個月Caspase-9mRNA與PBAC 評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.514、-0.633，P均<0.001）；治療后3、6 個月Caspase-9mRNA 與子宮內(nèi)膜厚度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.486、-0.597，P均<0.001）。

2.5 SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 預(yù)測緩解的效能

治療后3、6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 均是療效的相關(guān)影響因素（P<0.05）。見表4。

表4 Logistic 回歸方程分析Table 5 Logistic regression equation analysis

治療后6 個月對療效影響的OR 值大于治療后3 個月，故以治療后6 個月個指標(biāo)作為源數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，治療后6 個月SPAG9mRNA 預(yù)測的AUC 為0.843（95%CI：0.768～0.902），截斷值≤0.24，敏感度為74.26%，特異度為88.00%，LivinmRNA 預(yù)測的AUC 為0.831（95%CI：0.754～0.892），截斷值≤7.1，敏感度為75.25%，特異度為84.00%，Caspase-9mRNA 預(yù)測的AUC 為0.772（95%CI：0.688～0.842），截斷值＞0.62，敏感度為51.49%，特異度為92.00%；各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測緩解的AUC 為0.902（95%CI：0.836～0.947），敏感度為73.27%，特異度為96.00%（P<0.05），見圖1。

圖1 預(yù)測ROCFigure 1 ROC for prediction

3 討論

SPAG9mRNA 定位于人類染色體17q21，是c-Jun 氨基末端激酶信號通路上的支架蛋白，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，SPAG9mRNA 在曼月樂環(huán)治療后獲得病理緩解患者中呈降低趨勢，非緩解患者SPAG9mRNA 在療程中無明顯變化，可評估患者病情程度。Trava-glino A 等［10］報道納入了27 項針對1 360 名女性的研究，采用免疫組化檢測SPAG9 蛋白在治療前及隨訪期間的變化，發(fā)現(xiàn)SPAG9 蛋白降低可預(yù)示保守治療的有效性，本研究觀點(diǎn)與之相似。曼月樂環(huán)在宮內(nèi)可緩慢釋放孕酮，引起子宮內(nèi)膜暫時性萎縮和間質(zhì)脫膜化，降低黏膜上皮層活性，并控制月經(jīng)出血量，逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜增生，抑制具有促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖作用SPAG9mRNA 的表達(dá)。可見當(dāng)SPAG9mRNA 在療程中呈降低趨勢時，表明曼月樂環(huán)治療具有可行性，否則可能意味著需終止保守治療，以防止病變的進(jìn)一步進(jìn)展，從而指導(dǎo)臨床選取合適的治療方式。

凋亡蛋白抑制因子是一類具有抗細(xì)胞凋亡的因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡蛋白酶活性中起到重要作用。Livin 是目前發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子家族中活性最強(qiáng)的抗凋亡因子，在多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著升高［11］。細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染Livin-siRNA 干擾序列，可沉默LivinmRNA 表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，減弱細(xì)胞的侵襲及遷移能力，提示LivinmRNA 與惡性生物學(xué)行為有關(guān)［12］。但關(guān)于LivinmRNA 在EAH 和EEC 曼月樂環(huán)療程中變化的報道鮮見。本研究創(chuàng)新性探討發(fā)現(xiàn)，曼月樂環(huán)治療后獲病理緩解患者LivinmRNA 呈降低趨勢，并低于非緩解患者，而非緩解患者隨著療程推進(jìn)，LivinmRNA 水平相似，提示LivinmRNA 可作為預(yù)測曼月樂環(huán)保守治療反應(yīng)性的分子標(biāo)志物。遺憾的是，由于本研究觀點(diǎn)的新穎性，缺乏更多報道的進(jìn)一步論證，尚不明確曼月樂環(huán)降低LivinmRNA 表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制，有待后續(xù)的深入研究。

細(xì)胞正常凋亡途徑受阻是異常增殖細(xì)胞生存期延長、發(fā)生惡性增殖的必經(jīng)環(huán)節(jié)。含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，其中Caspase-9 作為線粒體介導(dǎo)通路的始動因子，可觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，獲病理緩解的EAH 和EEC 患者，在曼月樂環(huán)療程中，Caspase-9mRNA 呈上升趨勢，非緩解患者Caspase-9mRNA 無明顯變化，呈現(xiàn)出療效預(yù)測的潛質(zhì)。治療后Caspase-9mRNA 水平升高，可介導(dǎo)EAH 異常增生細(xì)胞及EEC 癌細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞異常增殖行為，從而促進(jìn)病情緩解。若療程中Caspase-9mRNA 降低或處于穩(wěn)定狀態(tài)，則預(yù)示療效不佳，應(yīng)調(diào)整治療手段，從而預(yù)防病情進(jìn)一步演變，改善患者預(yù)后。另SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 聯(lián)合預(yù)測緩解的AUC 最大，提示聯(lián)合檢測三者能進(jìn)一步提高預(yù)測價值。本研究不足之處在于，因EAH 病例數(shù)較少，故將EAH 和EEC 放在一起進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，而EEC 患者數(shù)量較多，可能造成數(shù)據(jù)的偏倚，有待后續(xù)的進(jìn)一步探討。