熒光PCR檢測高血壓用藥相關(guān)基因多態(tài)性方法的建立

劉秀卿 李延武 黃磊

藥物代謝的遺傳差異和藥物作用靶點如受體的遺傳多態(tài)性是影響個體對藥物反應(yīng)的主要因素。已明確與高血壓藥物治療顯著相關(guān)的基因主要包括CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE等藥物代謝酶及其受體［1-4］。其中在中國人群中有多態(tài)性意義的基因突變，包括CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）等［5-7］。目前高血壓用藥基因檢測主要有四種方法：測序、PCR-RFLP、基因芯片和PCR-熔解曲線。前三者操作繁瑣，費時費力，難以滿足臨床常規(guī)檢測需求，而PCR-熔解曲線的特異性及結(jié)果判斷的簡易程度不及熒光PCR。熒光PCR 具有高靈敏性、高特異性、操作簡便、結(jié)果判斷簡單等特點，便于臨床常規(guī)檢測。本研究旨在建立一種簡單、準(zhǔn)確的熒光PCR 法，檢測CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）位點的多態(tài)性，為高血壓藥物臨床使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

收集2017年6月至2019年1月本院EDTA-K2抗凝全血樣本362 份（含高血壓93 例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：已完成高血壓基因芯片檢測的住院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有精神病、血液病、腫瘤病史患者；②無法完成檢測的樣本；③所有患者彼此無親緣關(guān)系。經(jīng)深圳市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，使用已完成檢測的剩余樣本，故豁免知情同意。

1.1.2 試劑和主要儀器

深圳菲鵬10×Taq buffer（Mg2+plus）、25 mmol/L dNTP（含dUTP）、HS-Taq Ex（5 U/μL）、UNG 酶、江蘇康為世紀(jì)核酸提取試劑（50326）、湖南宏灝高血壓基因芯片檢測試劑（201811001）；深圳亞能YN-16 雜交儀、美國美谷Genepix 4100A 生物芯片掃描儀、杭州博日FQD-96A 熒光PCR 儀、德國Implen P-330-31 超微量分光光度計。

1.2 方法

提取標(biāo)本DNA 置-70℃冰箱保存待用。引物探針設(shè)計 用Primer Premier 5.0 及Primer Express 3.0 軟件設(shè)計引物和探針組。見表1。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至賽默飛世爾科技廣州測序中心進(jìn)行雙向序列測定?；蛐酒瑱z測操作參照儀器和試劑說明書。

熒光PCR反應(yīng)：分5管進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL，包括Taq Buffer 2 μL，HS-Taq Ex 0.2 μL，UNG 酶0.05 μL，dNTP2 μL，10 μmol/L 引物對及探針各0.2 μL；DNA 1.5 μL，ddH2O 13.45 μL。循環(huán)參數(shù)：37℃10 min；95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，共40 個循環(huán)，在延伸階段60℃收集熒光信號。見表2。

表2 熒光PCR 結(jié)果判讀Table 2 Results interpretation of fluorescence PCR

性能評價：檢出限：將各位點H 型、W 型、M 型的核酸用TE 緩沖液分別稀釋至50、30、20、10 和5 ng/μL，用熒光PCR 檢測3 次，型別正確即符合。重復(fù)性：稀釋至20 ng/μL 分3 批檢測，每批檢測8次，計算FAM 和VIC 通道Ct 平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，CV<5%為合格?？垢蓴_能力：分別加入3 200 mg/dL 甘油三酯、200 g/dL 血紅蛋白、150 mg/dL 膽紅素、2 倍治療濃度的高血壓常用藥物，共90 個樣本。提取后檢測。臨床樣本檢測及準(zhǔn)確度：用三種方法分別檢測362 例樣本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析；采用四格表分析，與基因芯片法相比，評價熒光PCR 法的符合率、特異性并進(jìn)行配對卡方檢驗；與測序法相比，評價熒光PCR 法的符合率、準(zhǔn)確性并進(jìn)行配對卡方檢驗；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢出限

結(jié)果顯示20 ng/μL 的樣本3 次檢測均型別正確。CYP2C9*35 ng/μL 和ADRB1（1165G>C）10 ng/μL H 型樣本FAM 通道均只有2 次有擴(kuò)增；ACE（I/D）10 ng/μL H 型樣本FAM 和VIC 通道都只有2 次有擴(kuò)增。見圖1。

圖1 熒光PCR 檢測結(jié)果Figure 1 The results real-time PCR

2.2 重復(fù)性

H 型、W 型、M 型批內(nèi)差及批間差均小于5%。見表3。

表3 重復(fù)性檢測結(jié)果（%）Table 3 Repeatability test results（%）

2.3 抗干擾能力

所有加入干擾物質(zhì)的樣本檢測CT 值與原始樣本CT 值的差值均在1 個CT 值以內(nèi)。見表4。

表4 抗干擾能力檢測結(jié)果Table 4 Test results of anti-interference ability

2.4 臨床樣本驗證與準(zhǔn)確性

其中有5 例CYP2D6*10熒光PCR 為W 型而基因芯片為H 型，另各1 例熒光PCR 為H 型和M型而基因芯片為M 型和H 型；還有3 例ACE（I/D）熒光PCR 為W 型而基因芯片為H 型；熒光PCR 基因分型與測序結(jié)果完全一致，符合率100%，見表5。各位點測序圖見圖2。362 例樣本分高血壓和非高血壓組，基因型分布。見表6。

表5 3 種檢測方法檢測結(jié)果對比分析Table 5 Comparative Analysis of the results of three detection methods

表6 高血壓組和非高血壓組各基因分布Table 6 Distribution of genes in hypertension group and non hypertension group

3 討論

CYP2D6*10多態(tài)性可影響美托洛爾、卡維地洛等藥物在體內(nèi)的代謝過程［8］；CYP2C9*3能降低依貝沙坦、甲苯磺丁脲等藥物的體內(nèi)清除率［1］；ADRB1是β1 腎上腺素受體類藥物的作用靶點，會影響藥物療效；AGTR1（1166A>C）能影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑類藥物的療效［9］；ACE（I/D）能影響ACE 抑制劑和β 受體拮抗劑類藥物的效應(yīng)［10-11］?；驒z測能讓醫(yī)生了解患者對不同降壓藥物的療效反應(yīng)及毒性，更好地進(jìn)行個性化治療。因此臨床急需建立一種快速簡便可以聯(lián)合檢測高血壓用藥相關(guān)基因的方法。

熒光PCR 法對362 例臨床樣本進(jìn)行檢測，總體CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）的基因型分布與張欣然等人的文獻(xiàn)報道一致［12］；而CYP2D6*10和ACE（I/D）的基因型分布與趙杰娉等人的報道不太一致［13］，這與選取特定樣本的分組有關(guān)。本實驗結(jié)果與李俊萍［14］等對石家莊漢族人群的ADRB1基因多態(tài)性研究結(jié)果相一致，這提示ADRB1基因中C 等位基因有可能是高血壓的易感基因。

熒光PCR 檢測CYP2C9*3、ADRB1 和AGTR1與基因芯片100%符合，CYP2D6*10、ACE的基因型符合率分別是98.07%、99.17%，檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。以Sanger 測序為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR 法的準(zhǔn)確性、特異性、敏感性均為100%，證實了熒光PCR 法的準(zhǔn)確性高于基因芯片法。準(zhǔn)確熒光定點、合理調(diào)節(jié)芯片亮度與對比度以及正確設(shè)立判定參數(shù)，均會影響基因芯片結(jié)果判定。此外，ACE 3 例插入型基因芯片為雜合型，可能由于插入型和缺失型有一段高度相似的序列導(dǎo)致；CYP2D6*10有7 例基因芯片與測序不一致，也可能CYP2D6*1/*10存在小概率突變［15］。熒光PCR 亦證實CYP2D6雜合子分型中C∶T 存在1∶1、1∶2、1∶3 的現(xiàn)象，但VIC 信號值不會低于FAM 1/2。無論是Sanger 測序、基因芯片還是熒光PCR，前期處理大致相同，前二者需后處理費時費力，而熒光PCR 操作簡單、準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、省時快速且結(jié)果判讀容易，能更好的服務(wù)病人與臨床。當(dāng)然熒光PCR 也有局限性，只可檢測已知的SNP 位點而不能發(fā)現(xiàn)未知的SNP 位點［16］。

綜上所述，熒光PCR 法能夠快速準(zhǔn)確對患者高血壓相關(guān)的功能意義明確且發(fā)生頻率較高的基因突變進(jìn)行分型，如果能夠擴(kuò)大樣本量并且進(jìn)行多中心臨床驗證，它將具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖2 測序結(jié)果Figure 2 Sequencing results