TIF1-γ重組蛋白的表達及其在抗TIF1-γ抗體ELISA檢測方法中的初步應用

韓冠華 林曉濤 孟慶勇 何林 錢純亙 程邦寧★ 徐軍發(fā)★

特發(fā)性炎性肌?。╥diopathic inflammatory my-opathy，IIM）是一組以對稱性四肢近端肌無力為特征表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性結(jié)締組織病，基于臨床癥狀及免疫病理特征，可將其分為不同的亞型，臨床上常見的亞型是皮肌炎（dermatomyositis，DM）。隨著研究的深入，陸續(xù)有學者發(fā)現(xiàn)IIM 患者血清中存在特異性的自身抗體，且此類抗體與IIM 患者的臨床表現(xiàn)和預后相關(guān)，有助于指導臨床醫(yī)生為患者制定個體化的治療方案［1-2］。其中抗轉(zhuǎn)錄中介因子1-γ（TranscriptionalIntermediary Factor 1-gamma，TIF1-γ）抗體是TARGOFF 等［3］于2006年通過免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）首次在肌炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體，后續(xù)的多項研究指出抗TIF1-γ 抗體可作為監(jiān)測DM 患者繼發(fā)惡性腫瘤的生物標志物［4］。檢測抗TIF1-γ 抗體的金標準是IP，但由于該方法涉及培養(yǎng)及使用細胞，步驟繁瑣，且需要使用放射性標記物，并不適用于臨床檢測。目前臨床上檢測抗TIF1-γ 抗體最常用的是抗肌炎抗體譜IgG 檢測試劑盒（歐蒙印跡法），但基于不同方法學之間特異性和敏感度會存在一定差異，應結(jié)合臨床癥狀和其它檢測方法（如ELISA、化學發(fā)光法等）對檢測結(jié)果進行綜合分析［5-6］。基于上述背景，本研究將分析TIF1-γ 重組蛋白作為診斷抗原的臨床應用價值，為開發(fā)抗TIF1-γ IgG 抗體檢測方法提供核心原料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

DH10Bac 感受態(tài)細胞、SF9 細胞由本實驗室保存；質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Ther-mo 公司；Flag 層析填料購自MBL 公司；抗Flag 標簽鼠單克隆抗體購自康為世紀生物科技有限公司；封閉液、偶聯(lián)物穩(wěn)定劑、TMB 底物購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；鼠抗人IgG-HRP 購自菲鵬生物股份有限公司；PCR 儀、酶標儀為BioRad 公司產(chǎn)品。

1.1.2 標本來源

抗TIF1-γ IgG 抗體陽性血清21 例，抗Jo-1 IgG 抗體、抗Scl-70IgG 抗體、抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體、類風濕因子（RF）和抗核抗體（ANA）各5 例，共25 例（疾病對照組）以及健康體檢者血清44 例（健康對照組），由本實驗室收集并保存，均已分離血清并保存在-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 表達質(zhì)粒pFastBac1-TIF1-γ 的構(gòu)建

從Uniprot 數(shù)據(jù)庫檢索得到人TIF1-γ 氨基酸序列（ID：Q9UPN9），按照昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)偏好對TIF1-γ 序列進行密碼子優(yōu)化，在C-端同時引入3×Flag 序列，委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。合成的TIF1-γ 基因為3 462 bp，其中5′端含BamHI 酶切位點，3′端含XhoI 酶切位點，經(jīng)BamHI和XhoI 雙酶切后插入到pFastBac1 載體，表達質(zhì)粒經(jīng)測序及雙酶切鑒定確認構(gòu)建的正確性。

1.2.2 TIF1-γ 重組蛋白的表達與純化

將pFastBac1-TIF1-γ 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細胞，使用LB 瓊脂平板（含50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環(huán)素、7 μg/mL 慶大霉素、100 μg/mL X-gal 和40 μg/mL IPTG）進行藍白斑篩選，分別挑取藍斑和白斑擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物用于提取重組桿粒，具體操作參考質(zhì)粒提取試劑盒說明書。使用M13 Forward/M13 Reverse 引物對重組桿粒進行PCR 鑒定。將鑒定正確的Bacmid-TIF1-γ 轉(zhuǎn)染至SF9 細胞，27℃培養(yǎng)72 h，500 g 離心15 min 收集上清即為第一代重組病毒（P1）；P1 用于感染正常SF9 細胞，擴增病毒得到P2；通過相同的方法得到P3，將P3 加入到懸浮培養(yǎng)的SF9 細胞，27℃，110 rpm 培養(yǎng)72 h，收獲細胞并進行離心和超聲處理，收集細胞裂解液，通過Flag 親和層析柱進行純化，收集表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE 和Western-Blot 分析。

1.2.3 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 的建立

TIF1-γ 重組蛋白包被96 孔板（400 ng/孔），商品化封閉液封閉；血清按1∶100 稀釋，每孔100 μL，37℃孵育1 h；PBS-T 洗板3 次后加入1∶10 000稀釋的HRP 標記的鼠抗人IgG，100 μL 每孔，37℃孵育30 min；再次清洗后，加入TMB 底物，37℃孵育10 min；最后加入終止液，酶標儀讀取OD 值。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，通過繪制受試者工作特征曲線（receiver opera-tion characteristic，ROC），確定自建抗TIF1-γ IgG抗體-ELISA 檢測臨界（cut-off）值。

2 結(jié)果

2.1 表達質(zhì)粒pFastBac1-TIF1-γ 的構(gòu)建及鑒定

電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條特異性條帶，其中一條位置約在3 400 bp 處為TIF1-γ 基因，另一條位置約在4 700 bp 處為載體pFastBac1。見圖1。

圖1 pFastBac1-TIF1-γ 雙酶切鑒定結(jié)果Figure 1 Restriction enzyme identification of pFastBac1-TIF1-γ

2.2 重組桿粒Bacmid-TIF1-γ 的鑒定

已發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid- TIF1-γ 條帶位置約在5 700 bp 處，未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid 條帶位置約在300 bp 處。見圖2。

圖2 Bacmid-TIF1-γ 擴增結(jié)果Figure 2 PCR result of the Bacmid-TIF1-γ

2.3 TIF1-γ 重組蛋白表達和純化

表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分析，目的蛋白條帶位置約在150 kD 處。Western-Blot 結(jié)果顯示，該目的條帶能與抗Flag 標簽抗體特異性結(jié)合。見圖3～4。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression protein products

圖4 TIF1-γ 重組蛋白Western-Blot 檢測Figure 4 The detection of TIF1-γ recombinant protein by Western Blot

2.4 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，OD 值=0.273 時約登指數(shù)最大，因此把cut-off 值選定為0.273，此時敏感度為100%，特異性為97.1%。見圖5。

圖5 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA ROC 曲線Figure 5 ROC curve of anti-TIF1-γ antibody-ELISA

3 討論

TIF1-γ 蛋白屬于TRIMs（Tripartite motif-con-taining）家族蛋白，具有一個RING 結(jié)構(gòu)域，可作為泛素連接酶E3 發(fā)揮作用，在腫瘤發(fā)生過程中扮演著重要的角色，如參與凋亡相關(guān)蛋白P53 的調(diào)控、抑制TGF-β 信號通路的活性等，推測這些蛋白的自身抗體可能是腫瘤發(fā)生過程中產(chǎn)生的，從而促進癌癥的發(fā)生［7-8］?？筎IF1-γ 抗體可作為監(jiān)測IIM 患者繼發(fā)惡性腫瘤的生物標志物。臨床上對于抗TIF1-γ 抗體陽性的IIM 患者，應注意密切隨訪，及時進行相關(guān)的腫瘤檢測。IP 被視為檢測該類自身抗體的金標準，但它并不適用于常規(guī)的臨床檢測，面對不斷增長的患者數(shù)量，建立有效、可靠、快速和簡便的抗TIF1-γ 抗體檢測方法非常有必要。為了驗證現(xiàn)有試劑的性能以及開發(fā)出更符合臨床需求的抗TIF1-γ 抗體檢測試劑，Aggarwal 等［9］以OriGene 公司的純化全長TIF1-γ重組蛋白作為包被抗原建立了基于ELISA 的抗TIF1-γ 抗體的檢測方法與IP 進行比較，總體符合率為93.9%，有高度的一致性（κ=0.87）。Mahler 等［10］用歐蒙印跡法與IP 共同測試一批DM 患者血清，其中抗TIF1-γ 抗體項目總體符合率為94.9%，κ=0.71（P<0.05），一致性較好。上述研究表明，以歐蒙抗肌炎抗體譜IgG 檢測試劑盒為代表的IB 檢測方法與金標準IP 有較好的一致性，同樣的，以ELISA 為原理所建立的檢測方法也有望替代IP。

本研究測試過程中發(fā)現(xiàn)2 例與歐蒙印跡法測試結(jié)果不符的樣本，推測出現(xiàn)不符的原因有以下幾點，一是包被抗原的純度。本研究得到的重組蛋白經(jīng)純化后通過SDS-PAGE 分析，存在較明顯的非目的條帶，猜測是目的蛋白降解產(chǎn)物，是否因此而產(chǎn)生了非特異性結(jié)合還有待驗證。二是固相載體材料的不同。ELISA 和IB 的固相材料分別為聚苯乙烯和硝酸素纖維膜，因此包被工藝可能會存在差異。如將蛋白包被在硝酸素纖維膜后，一般需要進行一定時間的烘干，此過程對蛋白的活性可能會造成一定的影響，而蛋白質(zhì)與酶標板的結(jié)合則是通過物理吸附作用，包被條件相對溫和。三是反應體系的不同。封閉液和緩沖液的選擇，如鹽離子的濃度、表面活性劑的種類及用量、是否需要添加額外的蛋白成分或阻斷劑等都有可能對測試結(jié)果產(chǎn)生影響。四是不同方法學之間特異性和敏感度會存在一定差異，且抗TIF1-γ IgG 抗體的檢測目前沒有可溯源的國際標準品，對于測試結(jié)果有存在爭議的樣本，應參考不同技術(shù)平臺的檢測結(jié)果并結(jié)合患者臨床表現(xiàn)進行綜合分析［11-12］。綜合上述四個方面，后續(xù)需通過金標準或第三方ELISA 試劑驗證兩例假陽性樣本是否為“真陰性”。另外有文獻報道，兩種自身抗體各自對應的靶抗原（Mi-2β 和TIF1-γ）有相似的氨基酸序列，抗Mi-2β 抗體會和TIF1-γ 蛋白結(jié)合，出現(xiàn)交叉反應［13］。后續(xù)仍需收集并測試更多疾病對照組樣本，探討是否存在能與本研究制備的TIF1-γ 重組蛋白結(jié)合的自身抗體，進一步評估自建ELISA 的特異性。綜上所述，本研究得到的TIF1-γ 重組蛋白在體外診斷試劑研發(fā)方面具有較好的應用前景，為開發(fā)抗TIF1-γ IgG 抗體檢測方法提供了核心原料?；诖酥亟M蛋白初步建立的抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 是一種特異和靈敏的血清學檢測方法，對臨床診斷和治療皮肌炎患者有一定的應用價值，可作為現(xiàn)有免疫印跡法試劑的良好補充。