?？诘貐^(qū)恙蟲病患者免疫損傷及臨床特征分析

王強(qiáng) 張麗媛 俞亞轉(zhuǎn) 杜永國(guó)

恙蟲病又稱叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamushi，OT）引發(fā)的自然疫源性疾病，以鼠類為主要傳染源，經(jīng)恙螨幼蟲叮咬傳播［1］。恙蟲病患者以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大、皮疹為主要臨床特征，嚴(yán)重時(shí)可并發(fā)呼吸窘迫綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血、胃腸道出血甚至死亡［2］。鑒于恙蟲病早期臨床癥狀特異性有限，極易誤診為傷寒、上呼吸道感染、肝炎或血液病，貽誤治療時(shí)機(jī)。同時(shí)，OT 基因型眾多，不同基因型的毒力和致病力也存在明顯差異［3］。因此，了解恙蟲病患者免疫損傷特點(diǎn)，并掌握其臨床特點(diǎn)，對(duì)于恙蟲病的早期鑒別診斷及治療有著重要意義。為此，本研究選取海南海口地區(qū)診斷恙蟲病的患者進(jìn)行研究。報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取海南?？诘貐^(qū)2015年1月至2020年1月診斷恙蟲病的患者297例，納入患者組?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)：①參照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心制定的恙蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］明確診斷；②入院前未接受抗生素治療，急性期全血、焦痂標(biāo)本保存完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他傳染性疾??；②合并免疫功能不全；③合并心、肝、腎等臟器嚴(yán)重病變。選擇同期100名健康體檢者，在征得其知情同意后，納入對(duì)照組?；颊呓M男132 例，女165 例，年齡平均（56.24±11.87）歲；對(duì)照組男43名，女57 名，年齡平均（55.91±12.04）歲。兩組受試者性別、年齡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。且經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫損傷檢測(cè)

分別于兩組受試者入組時(shí)，取其外周血標(biāo)本，檢測(cè)其外周血淋巴細(xì)胞、自然殺傷（Natural killer cell，NK）細(xì)胞、炎性因子水平，外周血淋巴細(xì)胞檢測(cè)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞及CD19+B 淋巴細(xì)胞；NK 細(xì)胞檢測(cè)亦使用流式細(xì)胞儀。炎性因子指標(biāo)包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-10、IL-15 及腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）。

1.2.2 臨床特征分析

整理患者組臨床表現(xiàn)特征，包括畏寒、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、焦痂或潰瘍、頭暈或頭痛等，計(jì)算其各項(xiàng)臨床表現(xiàn)占比。

1.2.3 分子流行特點(diǎn)分析

取患者組全血標(biāo)本，提取總DNA，行OT 目標(biāo)基因擴(kuò)增，而后行巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），將PCR 第2 輪反應(yīng)產(chǎn)物使用QIAxcel Advanced 全自動(dòng)實(shí)時(shí)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分析，選500 bp 條帶陽(yáng)性的樣品送測(cè)序。核苷酸序列經(jīng)拼接后，使用MegAlign 軟件行分析處理，其他用于參比的標(biāo)準(zhǔn)株序列下載自GenBank，結(jié)合本研究獲得的序列，使用BLAST 行同源性檢索，Clustal X 進(jìn)行序列排隊(duì)，對(duì)代表株序列進(jìn)行同源性分析比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（）表示，采用雙側(cè)t檢驗(yàn)；當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫損傷特點(diǎn)

患者組CD3+T、CD4+T、CD8+T、IL-6、IL-8、IL-18、IL-15、TNF-α、IFN-γ 淋巴細(xì)胞水平高于對(duì)照組，患者組NK 細(xì)胞、CD19+B 淋巴細(xì)胞水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1～2。

表1 兩組受試者外周血淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞水平比較（±s）Table 1 Comparison of peripheral blood lymphocytes and NK cells between the two groups（±s）

表1 兩組受試者外周血淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞水平比較（±s）Table 1 Comparison of peripheral blood lymphocytes and NK cells between the two groups（±s）

組別患者組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)297 100 CD3+T 淋巴細(xì)胞（%）74.31±1.82 56.12±2.43 79.040<0.001 CD4+T 淋巴細(xì)胞（×106/L）574.49±40.81 215.33±17.95 85.220<0.001 CD8+T 淋巴細(xì)胞（×106/L）597.92±94.11 208.87±60.51 38.715<0.001 NK 細(xì)胞（%）15.52±0.69 23.26±2.16 54.191<0.001 CD19+B 淋巴細(xì)胞（%）9.12±0.99 19.51±1.03 89.851<0.001

表2 兩組受試者炎性因子水平比較（ng/L，±s）Table 2 Comparison of inflammatory factors between the two groups（ng/L，±s）

表2 兩組受試者炎性因子水平比較（ng/L，±s）Table 2 Comparison of inflammatory factors between the two groups（ng/L，±s）

組別患者組對(duì)照組t 值P 值n 297 100 IL-6 39.15±7.21 2.91±0.48 50.184<0.001 IL-8 14.13±1.29 2.68±0.55 86.106<0.001 IL-10 33.15±2.96 2.74±0.39 102.354<0.001 IL-15 7.13±0.88 1.01±0.12 69.272<0.001 TNF-α 37.19±5.24 10.81±0.69 50.156<0.001 IFN-γ 45.43±3.99 4.11±0.78 102.817<0.001

2.2 臨床特征

患者臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、畏寒為主，分別占100.00%、90.91%、70.03%，見表3。

表3 297 例恙蟲病患者臨床特征分析Table 3 Clinical characteristics of 297 cases of tsutsugamushi disease

2.3 基因型分布

297 例恙蟲病患者中以O(shè)T 基因型以Karp 型為主，占186（62.63%），其次為Gilliam 型，占53（17.85%），依次是Kato，占39（13.13%）、TA763，占18（6.06%），其中有1 例是未確定的。

2.4 基因序列同源性分析

同源性分析結(jié)果顯示，297 例恙蟲病患者OT代表株與臺(tái)灣KM08、KM05 同源性較高，見表4。

表4 297 例恙蟲病患者OT 代表株與參考株56 kDa 蛋白基因序列同源性（%）Table 4 Homology of 56 kDa protein gene between OT representative and reference strain in 297 of tsutsugamushi disease（%）

3 討論

恙蟲病廣泛流行于亞太地區(qū)的熱帶及亞熱帶區(qū)域［5］，海南?？诘貐^(qū)具有獨(dú)特的熱帶、亞熱帶氣候特征，是恙蟲病的高發(fā)地區(qū)。據(jù)報(bào)道，2006～2017年，海南恙蟲病發(fā)病率居全國(guó)前4 位［6］，且以6～9月為發(fā)病高峰。其原因一方面為6～9月氣候濕熱、降雨量高，為鼠類、恙螨生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了有利條件。另一方面，6～9月是海南?？诘貐^(qū)農(nóng)作物收獲時(shí)節(jié)，增加了恙螨侵襲機(jī)會(huì)［7-8］。

外斐反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)室診斷恙蟲病的常規(guī)手段，但其靈敏性、特異性均處于較低水平，難以及時(shí)達(dá)到診斷目的［9］。加之恙蟲病臨床表現(xiàn)復(fù)雜、臨床重視程度不高，均使其漏診率、誤診率處于較高水平［10-11］。漏診、誤診不僅會(huì)加劇病情進(jìn)展、貽誤治療時(shí)機(jī)，也使患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，甚至因病情加劇、多系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生而影響生存質(zhì)量［12］。因此，明確恙蟲病的臨床特征并開展早期診治，是控制疾病進(jìn)展、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

免疫損傷是急性傳染病的重要致病機(jī)制［13］，全面掌握恙蟲病患者的免疫損傷特點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)臨床診斷及療效評(píng)估有著重要意義。NK 細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，可直接誘導(dǎo)被病毒感染的細(xì)胞死亡，與機(jī)體抗病毒免疫密切相關(guān)［14］，恙蟲病患者NK 細(xì)胞的下降意味著由NK 細(xì)胞導(dǎo)致的免疫攻擊有所下降，機(jī)體固有免疫難以發(fā)揮有效的殺滅病原體作用；CD19+是B 細(xì)胞增殖，分化、活化及抗體產(chǎn)生有關(guān)的重要膜抗原，其水平下降意味著機(jī)體免疫功能下降，也是恙蟲病常見臨床病理改變。同時(shí)，恙蟲病患者亦存在IL-6、IL-8、IL-18、IL-15、TNF-α、IFN-γ 顯著升高的表現(xiàn)，說明恙蟲病患者處于明顯免疫失調(diào)狀態(tài)，這一狀態(tài)常導(dǎo)致器官損傷加劇。因此，關(guān)注并調(diào)控恙蟲病患者免疫損傷，對(duì)于指導(dǎo)病情評(píng)估、改善患者預(yù)后有著重要意義。

在臨床特征的分析中，可以發(fā)現(xiàn)，患者臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、畏寒為主，與過往報(bào)道一致，提示臨床在發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在發(fā)熱、焦痂或潰瘍、畏寒的患者時(shí)，應(yīng)高度懷疑恙蟲病并開展相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室檢查。另外，患者OT 基因型以Karp 型為主，占62.63%，與我國(guó)廣州、臺(tái)灣等地區(qū)OT 優(yōu)勢(shì)基因型一致［15］，且患者OT 代表株與臺(tái)灣KM08、KM05 同源性較高，說明海南?？诘貐^(qū)OT 基因型呈現(xiàn)多樣化趨勢(shì)，其來源也較為復(fù)雜。加強(qiáng)分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，普及恙蟲病健康教育，提高臨床對(duì)恙蟲病的認(rèn)知，均為遏制恙蟲病在海南?？诔掷m(xù)流行高發(fā)的重要措施。

綜上所述，海南?？诘貐^(qū)恙蟲病患者存在明顯免疫損傷，并以體液免疫增強(qiáng)、細(xì)胞免疫減弱及促炎因子大量釋放為主，患者臨床表現(xiàn)特異性有限，其OT 基因型呈現(xiàn)多樣性但以Karp 型為主，來源亦較為復(fù)雜，應(yīng)予以高度重視。