5種食用菌多糖及復配多糖對RAW264.7細胞的免疫調節(jié)作用

董楠，李明智，徐德昌，陳曉敏，諶淑平，潘世杰，王玉簫，劉文婷，胡婕倫，鐘虹光，堯梅香，謝明勇，聶少平*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中加食品科學技術聯(lián)合實驗室（南昌），江西 南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西 九江 330000）

“藥食同源”食材因具有食養(yǎng)特性受到廣泛關注[1]。在“藥食同源”食材中，食用菌因具有許多保健功能，成為食療的矚目對象[2]。多糖是食用菌中發(fā)揮功效的重要活性物質，其中，銀耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharide）具有抗衰老、降血糖、降血脂的作用[3-4]；茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide）具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[5]；香菇多糖（lentinan）具有抗氧化、抗病毒、抗炎性損傷等作用，被廣泛應用于臨床輔助治療腫瘤[6]；猴頭菇多糖（Hericium erinaceus polysaccharide）具有改善胃腸道功能、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等生理功能[7]。竹蓀多糖（Dictyophora indusiata polysaccharide）在抗炎[8]、抗氧化[9-10]、抗腫瘤[11-14]等方面都有一定的效果。機體的免疫調節(jié)活性與這些生理功能息息相關，這是因為免疫系統(tǒng)的正常運行與否與機體各種生理和病理功能密切相關，例如炎癥、癌癥和腫瘤等的發(fā)生皆是機體免疫系統(tǒng)紊亂的結果[15]。然而，由于多糖的結構復雜，不同來源的多糖對不同類型免疫細胞的刺激程度可能有所差別。因此，通過調節(jié)不同來源多糖的配比，復配多糖將能發(fā)揮出更顯著的免疫調節(jié)作用[16]。

機體免疫系統(tǒng)包括特異性免疫和非特異性免疫，巨噬細胞在其中起到橋梁連接作用，生理功能廣泛。因此，巨噬細胞在機體免疫系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。當抗原入侵人體時，作為重要防御之一的巨噬細胞釋放的免疫介質發(fā)揮重要作用。同理，當人體受到機械損傷或病理刺激時，巨噬細胞被激活，吞噬能力增強，并分泌各種細胞因子[17-21]。因此，若要對某一功能成分進行免疫調節(jié)作用體外研究，小鼠巨噬細胞RAW264.7是理想模型。本試驗以RAW264.7細胞為研究對象，構建非炎癥模型，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為陽性對照，銀耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴頭菇多糖、竹蓀多糖及其復配多糖為樣品對照，探究這5種多糖及復配多糖對巨噬細胞的細胞活力、吞噬能力、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌水平的影響，評價這5種多糖及復配多糖的免疫調節(jié)活性，以期為后續(xù)進一步的深入研究及產(chǎn)品研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳多糖、猴頭菇多糖：江中食療科技有限公司哆糖君研究組提供；茯苓多糖、香菇多糖、竹蓀多糖：南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室制備。

小鼠巨噬細胞系RAW264.7：中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM（Dulbecco's modified Eagle Medium）培養(yǎng)基：中國北京Solarbio公司；胎牛血清：Biological Industries公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：中國上海碧云天生物技術有限公司；FITC-葡聚糖（FITC-Dextran）：美國 Sigma公司；細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）：日本同仁化學研究所；小鼠TNF-α ELISA試劑盒：中國武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

3110 Series II細胞培養(yǎng)箱、Varioskan Flash多功能酶標儀：美國Thermo公司；ZDX-35B高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠 ；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus公司；3K15冷凍離心機：德國Sigma公司；Milli-Q50超純水凈化系統(tǒng)：Millipore公司；CytoFLEX S流式細胞儀：美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖及其復配多糖溶液的配制

稱取一定量的銀耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴頭菇多糖和竹蓀多糖干燥粉末，用加入了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制為質量濃度為320 μg/mL的母液；任意2種多糖母液按1∶1體積比復配成質量濃度為320 μg/mL的復配多糖培養(yǎng)基溶液，然后以加入了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作稀釋液，將多糖及復配多糖母液分別稀釋為 160、80、40、20、10、5 μg/mL的溶液備用。復配方式及命名如表1所示。

表1 食用菌多糖復配方式及命名Table 1 The compounding method and naming of edible fungi polysaccharides

1.3.2 5種食用菌多糖總糖含量的測定

總糖含量利用苯酚硫酸法測定[22]，稍作修改，具體操作如下：配制0.25 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，各用水補足至 1.0 mL，加入3%苯酚0.5 mL，混勻，最后緩慢加入濃硫酸5.0 mL，混合均勻后（21±2）℃反應30 min于490 nm處測定吸光度，以1.0 mL水按同樣操作作為空白，并繪制標準曲線。

各取1 mL濃度為0.1 mg/mL的多糖待測樣品溶液，根據(jù)上述標準曲線的測定方法測定其吸光度，并根據(jù)標準曲線求得樣品總糖含量。

1.3.3 RAW264.7細胞培養(yǎng)與傳代

小鼠巨噬細胞系RAW264.7于DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部約80%時進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)試驗[23]。

1.3.4 CCK-8檢測細胞活力

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于96孔板中，接種密度為 105個/mL，每孔 100 μL，37℃培養(yǎng) 4 h～12 h待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。將細胞分為正常對照組、樣品組和陽性組，正常對照組加入100 μL培養(yǎng)基，樣品組加入100 μL用培養(yǎng)基配制的多糖或復配多糖培養(yǎng)基溶液，多糖和復配多糖的濃度均為5、10、20、40、80、160、320 μg/mL，陽性組加入 100 μL、濃度為1 μg/mL的LPS培養(yǎng)基溶液。另設置只含培養(yǎng)基不含細胞的陰性對照組，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h～4 h后用酶標儀在450 nm處測定吸光度。根據(jù)吸光度值，對不同濃度樣品處理后RAW264.7細胞的細胞活力進行比較分析，并確定后續(xù)試驗中樣品的濃度范圍，細胞活力用以下公式計算。

細胞活力/%=（A2-A0）/（A1-A0）×100

式中：A0為陰性對照組吸光度；A1為正常對照組吸光度；A2為樣品組或陽性組吸光度。

1.3.5 TNF-α濃度測定

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞按每孔5×105個/mL接種于24孔板中，貼壁4 h，各組分別加入500 μL培養(yǎng)基或者樣品培養(yǎng)基溶液，樣品組多糖及復配多糖濃度為 5、10、20、40、80、160 μg/mL，培養(yǎng) 12 h 后，收集上清液進行測定[24]。TNF-α分泌水平的測定按照酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書進行。

1.3.6 流式細胞儀檢測吞噬能力

取對數(shù)生長期的細胞按106個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，分別加入不同濃度的各多糖及復配多糖（40、80、160 μg/mL）培養(yǎng)基溶液，同時另設置2個對照組，分別為正常對照組和LPS陽性組（1 μg/mL）。培養(yǎng)24 h后棄上清，將細胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2次，然后再分別加入1 mL 1 mg/mL FITC-Dextran的PBS，37℃避光孵育1 h，用冷PBS中止反應，再用PBS清洗2次，離心，收集細胞，用0.5 mL PBS重懸，用流式細胞儀檢測分析[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，試驗結果用平均值±標準差表示，且P<0.05表示數(shù)據(jù)有顯著差異，P<0.01表示數(shù)據(jù)有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 5種食用菌多糖的總糖含量

食用菌多糖總糖含量見表2。

表2 食用菌多糖總糖含量Table 2 The content of total polysaccharides in edible fungi polysaccharides

如表2所示，測得銀耳多糖總糖含量為77.29%；茯苓多糖、香菇多糖、猴頭菇多糖和竹蓀多糖的總糖含量分別為88.77%、71.00%、92.96%和95.25%。

2.2 5種食用菌多糖單獨作用于RAW264.7的免疫調節(jié)作用

2.2.1 5種食用菌多糖對RAW264.7細胞活力的影響

5種食用菌多糖對RAW264.7細胞活力的影響見圖1。

圖1 5種多糖對RAW264.7細胞活力影響Fig.1 Effects of five kinds of polysaccharides on RAW264.7 cell viability

巨噬細胞體外增殖能力可作為一項評價其免疫調節(jié)活性的指標[25]。如圖1所示，與正常對照組相比，不同濃度的5種食用菌多糖都對RAW264.7細胞的細胞活力產(chǎn)生影響，且細胞活力普遍顯著高于正常對照組，說明多糖促進了細胞的增殖。銀耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖在檢測濃度（5 μg/mL～320 μg/mL）范圍內均顯著增強細胞活力，而猴頭菇多糖僅在高濃度（160 μg/mL 和 320 μg/mL）時表現(xiàn)出促進效果，竹蓀多糖在濃度為10 μg/mL～160 μg/mL范圍內顯著增強細胞活力，在濃度為5 μg/mL和320 μg/mL時能促進RAW264.7細胞的細胞活力，但與正常對照組無顯著性差異。結果表明，在合適的濃度時，5種食用菌多糖均可顯著增強RAW264.7的細胞活力，即顯著增強其增殖能力，從而提高免疫調節(jié)活性。結果顯示5種食用菌多糖在320 μg/mL時的細胞活力皆呈現(xiàn)下降趨勢，推測可能是多糖刺激巨噬細胞過度活化，使其發(fā)生紊亂。綜合5種食用菌多糖對RAW264.7細胞的細胞活力影響的結果，選擇 5、10、20、40、80、160 μg/mL這6個劑量來檢測細胞因子分泌水平情況，另外選擇40、80、160 μg/mL這3個劑量來檢測其吞噬能力。

2.2.2 5種食用菌多糖對RAW264.7細胞分泌的TNF-α的影響

5種多糖對TNF-α的分泌的影響見圖2。

圖2 5種多糖對TNF-α的分泌的影響Fig.2 Effects of five kinds of polysaccharides on levels of TNF-α

TNF-α是一種主要由巨噬細胞和淋巴細胞分泌的細胞因子，在宿主防御機制中發(fā)揮重要作用，對腫瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用[26]。在非炎癥巨噬細胞模型中，細胞因子的分泌水平可以作為評估免疫激活和調節(jié)能力的指標[27]。從圖2可以看出，除了濃度為10 μg/mL和40 μg/mL的猴頭菇多糖，其他濃度的各多糖刺激后，RAW264.7細胞分泌TNF-α水平明顯增強。其中，銀耳多糖的增強作用效果不如其他4種多糖。在5 μg/mL～80 μg/mL的濃度范圍內，香菇多糖刺激后的細胞分泌TNF-α水平較穩(wěn)定，且在160μg/mL時效果最好，茯苓多糖在80 μg/mL和160 μg/mL時，細胞分泌TNF-α水平僅次于160 μg/mL的香菇多糖。綜合考慮多糖在不同劑量下效果，茯苓多糖和香菇多糖促進TNF-α分泌的效果最好，竹蓀多糖次之，然后是猴頭菇多糖和銀耳多糖。

2.2.3 5種食用菌多糖對RAW264.7吞噬能力的影響

5種食用菌多糖對RAW264.7吞噬能力的影響見圖3。

愛“嚼舌根”有三個原因：①被人關注的需要?！敖郎喔钡幕咎卣魇沁^度分享第三者秘密。②釋放壓力的需要。掌握了別人秘密的人，不說出來難受，所以便采用了“嚼舌根”的方式來傾訴秘密。③親密交往的需要?！敖郎喔闭弑举|上是希望獲得友誼、促進關系。

圖3 5種多糖對RAW264.7吞噬FITC-Dextran的影響Fig.3 Effects of five kinds of polysaccharides on phagocytosis of FITC-Dextran by RAW264.7

巨噬細胞是非特異性免疫的組成部分，可吞噬外來病原體和自身異變細胞，其吞噬能力可直接反映機體免疫功能[25]。圖3表明5種食用菌多糖均極顯著地增強了RAW264.7細胞的吞噬能力。茯苓多糖、香菇多糖和猴頭菇多糖劑量依賴性增強RAW264.7細胞的吞噬能力，而竹蓀多糖劑量依賴性減弱吞噬能力。從平均熒光強度來看，銀耳多糖的增強吞噬能力效果不如其他4種多糖，香菇多糖的效果優(yōu)于其他4種食用菌多糖。

2.3 復配多糖對RAW264.7的免疫調節(jié)作用

2.3.1 10種復配多糖對RAW264.7細胞活力的影響

10種復配多糖對RAW264.7細胞活力的影響見圖4。

圖4 不同復配食用菌多糖對RAW264.7細胞活力的影響Fig.4 The effects of different compound edible fungi polysaccharides on RAW264.7 cell viability

如圖4所示，與正常對照組相比，除復配多糖201外，其余9種復配多糖在濃度為5 μg/mL～160 μg/mL皆可顯著提高RAW264.7的細胞活力。促進效果較好的為銀耳多糖-竹蓀多糖的復配多糖204和茯苓多糖-竹蓀多糖的復配多糖207，且復配多糖207在濃度為5 μg/mL時，促進細胞增殖作用最強。

復配多糖201只有在10 μg/mL時顯著性增強RAW264.7的細胞活力，復配多糖203劑量依賴性顯著增強RAW264.7的細胞活力，復配多糖206和209劑量依賴性減弱RAW264.7的細胞活力，除在濃度320 μg/mL時，細胞活力與正常對照組相比，沒有顯著性差異，其他濃度均顯著性增強細胞活力。

2.3.2 10種復配多糖對RAW264.7細胞分泌的TNF-α的影響

10種復配多糖對RAW264.7細胞分泌的TNF-α的影響見表3。

表3 不同復配食用菌多糖對巨噬細胞株RAW264.7細胞因子分泌的影響Table 3 The effect of different compound polysaccharides on cytokine secretion of macrophage cell line RAW264.7

2.3.3 10種復配多糖對RAW264.7吞噬能力的影響

10種復配多糖對RAW264.7吞噬能力的影響見圖5。

圖5 復配多糖對RAW264.7吞噬FITC-Dextran的影響Fig.5 Effects of compound polysaccharides on phagocytosis of FITC-Dextran by RAW264.7

如圖5所示，與正常對照組相比，10種復配多糖均能夠顯著增強巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力。在10種復配多糖中，基于茯苓多糖和香菇多糖的復配多糖在40 μg/mL～160 μg/mL時，其吞噬效果均優(yōu)于其它9種復配多糖。同時，發(fā)現(xiàn)效果較好是基于銀耳多糖-香菇多糖的復配多糖202、基于茯苓多糖-香菇多糖的復配多糖205、基于茯苓多糖-猴頭菇多糖的復配多糖206和基于茯苓多糖-竹蓀多糖的復配多糖207，結合圖3中5種多糖單獨作用于RW264.7時對吞噬能力的增強效果，發(fā)現(xiàn)茯苓多糖和香菇多糖的增強吞噬能力也是更優(yōu)的，說明可能還是某一類效果更好的多糖在發(fā)揮作用，后續(xù)可以進行更深入研究。

2.4 復配多糖與其組成多糖對RAW264.7的免疫調節(jié)作用的比較

2.4.1 對RAW264.7細胞分泌的TNF-α的影響的比較復配多糖與單獨多糖對TNF-α的分泌的影響見圖6。

圖6 復配多糖與單獨多糖對TNF-α的分泌的影響Fig.6 Effects of compound polysaccharides and single polysaccharides on levels of TNF-α

由2.3.2中結果可知，復配多糖中對RAW264.7細胞提高TNF-α分泌水平影響較大的是復配多糖208，將復配多糖208及其組成多糖單獨作用時對RAW264.7分泌TNF-α的影響進行比較。從圖6可以得出，基于香菇多糖和猴頭菇多糖復配而成的復配多糖208提高TNF-α分泌水平的效果優(yōu)于猴頭菇多糖，但并未優(yōu)于香菇多糖。分析可能是香菇多糖單獨作用時提高TNF-α分泌水平效果就已經(jīng)達到最優(yōu)，復配后的效果也不能超越，與2.2.2中結果香菇多糖單獨作用時提高TNF-α分泌水平效果的結果一致。結合表3可知，復配多糖205、208、209的效果在10種復配多糖中表現(xiàn)較優(yōu)，這3種復配多糖中均含香菇多糖，應該是香菇多糖在其中發(fā)揮作用。同時比較了其余9種復配多糖與其組成多糖單獨作用時提高TNF-α分泌水平效果，發(fā)現(xiàn)復配多糖204在多糖濃度為80 μg/mL時提高TNF-α分泌水平效果優(yōu)于其組成多糖銀耳多糖和竹蓀多糖。

2.4.2 對RAW264.7吞噬能力的影響的比較

由2.3.3中結果可知，復配多糖中對RAW264.7吞噬能力影響較大的是復配多糖205，圖7展示了茯苓多糖、香菇多糖及其復配得到的復配多糖205的吞噬能力比較結果。

圖7 復配多糖與單獨多糖對RAW264.7吞噬FITC-Dextran的影響Fig.7 Effects of compound polysaccharides and single polysaccharides on phagocytosis of FITC-Dextran by RAW264.7

由圖7可知復配多糖205對RAW264.7的吞噬能力的增強效果優(yōu)于茯苓多糖和香菇多糖單獨作用時的效果。由此推測，多糖間可能會存在一定相互作用，使其作用效果更好。同時，也比較其余9種復配多糖與其組成多糖單獨作用時對RAW264.7細胞增強吞噬能力效果，其中復配多糖204在多糖濃度為160 μg/mL時增強效果優(yōu)于單獨作用時的銀耳多糖和竹蓀多糖。

3 結論

5種食用菌多糖單獨作用及其兩兩復配得到的復配多糖都可通過增強細胞活力，提升吞噬能力，促進TNF-α的分泌來發(fā)揮積極的免疫調節(jié)作用。同時，10種復配多糖中，復配多糖204和復配多糖207的促進細胞增殖效果較好；復配多糖208的提高TNF-α分泌水平效果較優(yōu)；復配多糖205的增強吞噬能力的效果最好，且優(yōu)于其組成多糖茯苓多糖和香菇多糖單獨作用時效果；復配多糖204在多糖濃度為80 μg/mL時提高TNF-α分泌水平效果優(yōu)于其組成多糖銀耳多糖和竹蓀多糖，在多糖濃度為160 μg/mL時增強效果優(yōu)于單獨作用時的銀耳多糖和竹蓀多糖。綜合以上結果，不同多糖經(jīng)兩兩復配后，復配多糖對RAW264.7的免疫調節(jié)效果可能會優(yōu)于其多糖單獨作用時效果。本研究結果可為食用菌多糖的免疫調節(jié)相關功能產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。