山竹殼多糖微波輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

張 鵬， 鄧清月， 唐 森， 謝濟(jì)運(yùn)

（1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西來賓546199；3.廣西科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣西來賓546199）

山竹為隸屬于藤黃科（Guttiferae）、藤黃屬（Garcinia）多年生小喬木植物莽吉柿（Garcinia mangostanaL.）的果實(shí)，又名山竺、山竹子、倒捻子（李錫文等，1990）。山竹殼約占鮮果重的2/3，無食用價(jià)值，多被視為廢棄物而扔掉。研究表明，山竹殼提取物具有抗氧化、保肝、抗炎、抗增殖、降血脂、抑菌、抗癌、修復(fù)腎臟損傷等多種作用（Karim等，2019；Tatiya等，2019；Taokaew等，2018；Widowati等，2018；Ying等，2017；Tsai等，2016；Samuagam等，2015；劉爽等，2012）。

植物多糖是植物體中廣泛存在的生物大分子物質(zhì)，是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一，同時(shí)具有多種生理活性（孟慶龍等，2020）。目前，關(guān)于山竹殼活性組分提取的研究主要集中于總黃酮、花色苷、總酚酸、蒽酮類和原花青素等物質(zhì)上（姚新鼎等，2019；Cheok等，2013；Palakawong等，2013；Wang等，2012；趙巖等，2012；秦菲等，2012），而關(guān)于山竹殼多糖提取工藝的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬以山竹殼為原料，采用無污染、省時(shí)高效的微波輔助提取法提取山竹殼多糖，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化山竹殼多糖的微波輔助提取工藝，通過DPPH自由基和羥基自由基清除試驗(yàn)評(píng)價(jià)山竹殼多糖的體外抗氧化活性，為山竹殼多糖的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 山竹，購于昆明郎碩商貿(mào)有限公司；無水乙醇、正丁醇、丙酮、氯仿、石油醚（沸程30～60℃）、濃硫酸、苯酚、L-抗壞血酸（VC）、無水葡萄糖、30%過氧化氫、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、2，2-聯(lián)苯基-1苦基肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；試?yàn)過程中使用的水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備 中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W-135）；數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，GZX-GF101-3-S）；電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A-2004B）；實(shí)驗(yàn)室微波合成儀（北京翔鵠科技發(fā)展有限公司，XH-MC-1）；臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，SHB-IIIG）；水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠，SHZ-82A）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S4，金坊市醫(yī)療儀器廠）；紫外-可見分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，UV-2600]；臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H-1850）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 挑選果殼鮮亮光滑、無黑點(diǎn)、無發(fā)霉變質(zhì)的山竹果，取果殼分割成1 cm2的小塊。置于干燥箱內(nèi)45℃恒溫烘干，粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩后，置于自封袋密封，儲(chǔ)于干燥避光處備用。

1.3.2 多糖提取工藝 參考徐兵等（2017）方法，準(zhǔn)確稱量山竹殼粉末1.0 g置于250 mL磨口錐形瓶中，按一定液料比加入蒸餾水后，置于微波合成儀中并連接冷凝管。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案所需的微波功率和微波時(shí)間等條件進(jìn)行提取。提取液經(jīng)減壓抽濾后，得抽濾液，用Sevage法除蛋白，3800 r/min離心10 min得上清液，加入3倍體積的無水乙醇后，置于4℃冰箱中醇沉15 h。含有絮狀物的醇沉液于4000 r/min離心15 min，棄去上清液，保留沉淀。依次用無水乙醇、丙酮和石油醚反復(fù)洗滌沉淀去除色素，沉淀用蒸餾水溶解定容于100 mL容量瓶中，即得山竹殼多糖待測(cè)液。

1.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 采用苯酚-濃硫酸法顯色，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400～800 nm對(duì)顯色后的山竹殼多糖待測(cè)液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)獲得的吸收光譜圖來確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照崔守富等（2020）報(bào)道方法，略有改動(dòng)。以干燥至恒重后的無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，分別以質(zhì)量體積濃度Cg（μg/mL）和吸光度值A(chǔ)為橫縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.0545Cg-0.0036，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，線性范圍為2.5～15.0μg/mL。

1.3.5 多糖含量的測(cè)定 取0.5 mL待測(cè)液于25 mL比色管中，按“1.3.4”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值，多糖提取量計(jì)算公式為：

式中：C為待測(cè)液稀釋后的多糖濃度，μg/mL；V為待測(cè)液定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為山竹殼粉末質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗(yàn) 按照“1.3.2”項(xiàng)方法提取山竹殼多糖，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，研究微波功率（200、300、400、500、600、700 W），微 波 時(shí) 間（60、120、180、240、300、360 s），液料比[20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1（V/m，mL/g）]對(duì)山竹殼多糖提取量的影響。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)行Design-Expert V8.0.6.1軟件中“Box-Behnken Design”程序進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以多糖提取量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)考察因素A（微波功率）、B（微波時(shí)間）和C（液料比）進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素與水平編碼設(shè)置見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.8 山竹殼多糖抗氧化活性

1.3.8.1 DPPH·清除能力測(cè)定 參照張鵬等（2019）方法，取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的山竹殼多糖溶液2.0 mL，分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混勻，室溫下避光靜置30 min后，用分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A1；取2.0 mL不同濃度的山竹殼多糖溶液，分別加入2.0 mL無水乙醇，測(cè)定吸光度，記為A2；向2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中加入2.0 mL無水乙醇，測(cè)定吸光度，記為A3。以同質(zhì)量濃度的BHT溶液和VC溶液為對(duì)照。山竹殼多糖對(duì)DPPH·的清除率（I）計(jì)算公式為：

1.3.8.2 ·OH清除能力測(cè)定 參照張鵬等（2019）方法，略作改動(dòng)。取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的山竹殼多糖溶液2.0 mL，依次分別加入10 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，經(jīng)37℃水浴反應(yīng)30 min后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定溶液吸光度，記為A1；用1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL H2O2溶液，按上述操作方法測(cè)定吸光度，記為A2；用1.0 mL蒸餾水代替山竹殼多糖溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，記為A3。以同質(zhì)量濃度的BHT溶液和VC溶液為對(duì)照。山竹殼多糖對(duì)·OH的清除率（I）計(jì)算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 用Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)；用IBM SPSS Statistics 19.0軟件中單因素ANOVA程序進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較；用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 由圖1所示，在400～800 nm內(nèi)，山竹殼多糖提取液及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后，最大吸收峰值在490 nm出現(xiàn)。故選擇490 nm為最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)也表明提取液中存在多糖類物質(zhì)。

圖1 山竹殼多糖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品顯色后的全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 微波功率對(duì)多糖提取量的影響 如圖2所示，當(dāng)微波功率小于500 W時(shí)，多糖提取量隨著微波功率的增大而顯著提高（P＜0.05），當(dāng)功率為500 W時(shí)達(dá)到峰值（17.51 mg/g）。原因可能是在一定功率范圍內(nèi)，增大微波功率能使體系溫度快速升高，加快多糖分子和溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng)，使山竹殼組織細(xì)胞破裂的速度加快，從而使提取量增大（吳美媛等，2014）。功率大于500 W時(shí)，提取量降低（P＜0.05）?？赡苁怯捎谖⒉üβ蔬^大導(dǎo)致體系溫度瞬間升高使得部分熱不穩(wěn)定的多糖類物質(zhì)發(fā)生分解，導(dǎo)致提取量減少（聶小偉等，2019）。故選取微波功率的優(yōu)化范圍為400～600 W。

圖2 微波功率對(duì)多糖提取量的影響

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響 如圖3所示，當(dāng)微波時(shí)間小于120 s時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取量升高（P＜0.05）。當(dāng)時(shí)間為180 s時(shí)達(dá)到峰值（17.39 mg/g）。這可能是因山竹殼組織結(jié)構(gòu)隨著微波時(shí)間延長(zhǎng)而遭到進(jìn)一步的破壞，更多的多糖物質(zhì)溶解到提取溶劑中，提高了多糖提取量（王婭玲等，2015）。當(dāng)時(shí)間大于180 s時(shí)，提取量下降（P＜0.05），這可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致反應(yīng)體系溫度過高而使部分多糖發(fā)生降解，同時(shí)隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，使得組織細(xì)胞破碎程度加大，細(xì)胞中其他水溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致多糖提取率不升反降（湯慧民等，2018）。故選取微波時(shí)間的優(yōu)化范圍為120～240 s。

圖3 微波時(shí)間對(duì)多糖取量的影響

2.2.3 液料比對(duì)多糖提取量的影響 圖4表明，當(dāng)液料比低于35：1（mL/g）時(shí)，多糖提取量隨溶劑用量的增大呈升高趨勢(shì)（P＜0.05），液料比為35：1（mL/g）時(shí)達(dá)到峰值（17.23 mg/g）。液料比高于35：1（mL/g）后，提取量呈緩慢下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑體積為原料質(zhì)量的35倍時(shí)，原料中的多糖類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增大溶劑使用量會(huì)造成其他水溶性雜質(zhì)成分的溶出，干擾多糖含量的測(cè)定（于平等，2017）。此外，過多提取溶劑會(huì)為后續(xù)的醇沉處理及溶劑回收操作帶來不便。故選取液料比的優(yōu)化范圍為30：1～40：1（mL/g）。

圖4 液料比對(duì)多糖提取量的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由表2可知，本次BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，可分為兩種類型。其中，第一類為12個(gè)析因點(diǎn)。第二類為3個(gè)自變量都取“0”水平的中心試驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)置5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)來檢驗(yàn)二次多項(xiàng)式回歸方程在研究區(qū)域內(nèi)是否失擬，同時(shí)提供的剩余自由度可以提高試驗(yàn)的精度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 表2中試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design-expert V8.0.6.1軟件中Analysis Process程序統(tǒng)計(jì)分析，得到編碼空間內(nèi)的擬合回歸方程為：Y=17.30+1.19A+0.73B+0.76C-0.18AB-1.19AC+0.018BC-1.06A2-1.88B2-2.05C2?；貧w系數(shù)的“+，-”號(hào)和絕對(duì)值的大小分別反映了自變量對(duì)響應(yīng)值影響的方向和程度大小。由表3可知，考察因素A、B、C對(duì)多糖提取量影響的主次順序?yàn)椋篈（微波功率）＞C（液料比）＞B（微波時(shí)間）；本次試驗(yàn)所選取的模型是極顯著的（F=66.08，P＜0.01）；失擬項(xiàng)不顯著（F=2.69，P＞0.05），表明本次試驗(yàn)無失擬因素存在，模型成立；對(duì)Y的影響達(dá)到極顯著效應(yīng)（P＜0.01）的有一次項(xiàng)A、B、C，交互作用項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2。

由表4可知，R2=0.9941，說明99.41%的響應(yīng)值變化都可以用該模型來解釋；R2adj=0.9866，說明模型有較好擬合度；CV=1.58%，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠性強(qiáng)、精確度高。綜上所述，該模型可以用來優(yōu)化、預(yù)測(cè)山竹殼多糖的微波輔助提取工藝。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 等高線密集，形狀呈橢圓形，響應(yīng)曲面陡峭說明因素取值的變化對(duì)響應(yīng)值影響大，兩因素之間的一級(jí)交互作用較大；反之，表明兩因素之間的一級(jí)交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響較?。ㄍ鯐?huì)賓等，2019；湯慧民等，2018；于平等，2017）。此外，還要結(jié)合方差分析的結(jié)果來分析交互作用的影響是否達(dá)到顯著效應(yīng)。如圖5和表3可知，AC對(duì)多糖提取量影響極顯著（P＜0.01），AB、BC影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸模型方差分析表

表4 回歸方程可信度分析

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 由圖5所示，所有響應(yīng)曲面圖開口均為向下，表明回歸模型有極值點(diǎn)。因此，運(yùn)行Design-expert V8.0.6.1軟件中的”Numerical”程序預(yù)測(cè)得出最佳工藝參數(shù)為：微波功率553.35 W、微波時(shí)間190.13 s、液料比35.23：1（mL/g），理論預(yù)測(cè)值為17.69 mg/g。綜合試驗(yàn)儀器性能和操作簡(jiǎn)便性考慮，將提取工藝參數(shù)修改為微波功率550 W、微波時(shí)間190 s、液料比35：1（mL/g），在此條件下，多糖提取量為17.83 mg/g（n=3，RSD=0.31%），與理論預(yù)測(cè)值接近。驗(yàn)證試驗(yàn)表明采用BBD試驗(yàn)優(yōu)化得到微波輔助提取山竹殼多糖的工藝條件具有較高的可靠性。

圖5 各因素交互作用對(duì)多糖提取量的影響

2.4 抗氧化性測(cè)定

2.4.1 DPPH·清除能力測(cè)定 由圖6可知，DPPH·清除率隨著多糖質(zhì)量體積濃度（0.2～1.4 mg/mL）的增加而升高，當(dāng)濃度為1.4 mg/mL時(shí)，最大清除率為88.31%。經(jīng)擬合得到回歸方程為Y=61.705X+9.5886，R2=0.9599，計(jì)算得到山竹殼多糖的IC50為0.65 mg/mL。結(jié)果表明，山竹殼多糖具有一定的DPPH·清除能力，但效果稍弱于陽性對(duì)照BHT和VC。

圖6 山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ·OH清除能力測(cè)定 由圖7可知，·OH清除率隨著多糖質(zhì)量體積濃度（0.2～1.4 mg/mL）的增加而升高，當(dāng)濃度為1.4 mg/mL時(shí)，最大清除率為86.01%。經(jīng)擬合得到回歸方程為Y=61.614X+1.3829，R2=0.9736，計(jì)算得到山竹殼多糖的IC50為0.79 mg/mL。結(jié)果表明，山竹殼多糖具有一定的·OH清除能力，但效果稍弱于陽性對(duì)照BHT和VC。

圖7 山竹殼多糖對(duì)OH自由基的清除作用

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)綜合分析得到山竹殼多糖最佳微波輔助提取工藝參數(shù)為：微波功率550 W、微波時(shí)間190 s、液料比35：1（mL/g），3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得出的多糖提取量為17.83 mg/g。山竹殼多糖有一定的DPPH·清除活性（IC50=0.65 mg/mL）和·OH清除活性（IC50=0.79 mg/mL）。本研究為從山竹殼中提取多糖提供了一種經(jīng)濟(jì)可行的方法，為山竹資源開發(fā)利用提供新思路。