對二氨基苯甲醛比色法測定羊肚菌中色氨酸含量

何峰，李婉茹，武貝貝

1. 西藏大學(xué)理學(xué)院（拉薩 850000）；2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院（林芝 860000）

羊肚菌（Morchella esculenta）又稱羊肚菜，屬于子囊菌亞門盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬，是世界上珍貴的稀有食用菌之一，羊肚菌屬多種蔭類子實體的統(tǒng)稱，因菌蓋部分凹凸呈蜂窩狀，形態(tài)酷似翻開的羊肚（胃）而得名。它是世界公認的著名珍稀食藥兼用菌，其香味獨特，營養(yǎng)豐富，功能齊全，食效顯著。富含多種人體需要的氨基酸和有機鍺，具補腎、壯陽、補腦，提神等功效。尤其抗癌作用明顯，對肌瘤細胞有強烈抑制作用，具有較高的食用價值和醫(yī)用價值，主要分布在云南、四川、甘肅、新疆、陜西、遼寧等地，安徽、河南境內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有羊肚菌。由于豐富的營養(yǎng)成分和重要的藥用價值，羊肚菌是天然、營養(yǎng)、多功能的健康食品。

色氨酸是人體所需八大必需氨基酸之一，在人體內(nèi)不能合成，只能通過攝取食物獲得，是人體重要的神經(jīng)遞質(zhì)-5-羥色胺的前體；具有安神、調(diào)節(jié)精神節(jié)律、改善睡眠等作用。對動物體而言，色氨酸可參與動物體內(nèi)血漿蛋白質(zhì)更新，可促使核黃素發(fā)揮作用，有助于煙酸及血紅素合成，可顯著增加懷孕動物胎仔體內(nèi)抗體，對泌乳期的乳牛和母豬有促進泌乳作用。畜禽缺乏色氨酸時，生長停滯，體重下降，脂肪積累降低，種公畜睪丸萎縮。在醫(yī)藥上用作癩皮病的防治劑[1-2]。

氨基酸的檢測方法有高效液相色譜法[3-7]、比色法（分光光度法、氯胺T法）[8-12]、電泳法、氨基酸分析儀測定法[5,13-15]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子交換色譜法[7,16]等，這些方法在樣品處理時均采用酸水解，由于酸水解會破壞色氨酸，故不適用L-色氨酸的測定。國內(nèi)外測定色氨酸的主要方法是高效液相色譜法、分光光度法、電位滴定法，液相色譜法和分光光度法是最常見的方法?？紤]到試驗成本及實驗室條件等因素，加上分光光度法是眾多方法中具有靈敏度高、定性定量結(jié)果準確、操作簡單等特點，廣泛應(yīng)用于氨基酸分析中的優(yōu)點，采用對二氨基苯甲醛比色法對羊肚菌中L-色氨酸進行測定，經(jīng)驗證，方法穩(wěn)定性好、準確度高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

羊肚菌樣品：購自西藏林芝市臧順堂特產(chǎn)店（用ST表示）、藏富康特產(chǎn)店（用FK表示）的林芝波密野生羊肚菌。樣品在105 ℃條件下烘干，粉碎后，置廣口瓶內(nèi)備用。

L-色氨酸、濃硫酸、對二氨基苯甲醛、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）。試驗所需色氨酸溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，盡可能在避光條件下使用。

1.1.2 儀器與設(shè)備

V-1100可見分光光度計（上海美析儀器有限公司）；UPH-II-10T實驗室超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；DGG-9076電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；移液槍；消解管。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

色氨酸標準溶液：準確稱取10 mgL-色氨酸，加入0.1 mL 10% NaOH和少量水溶解，移至100 mL容量瓶中，用水定容，備用。分別取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL色氨酸溶液至10 mL比色管內(nèi)，各用蒸餾水定容至1 mL，加1 mL 6 mol/L的NaOH和5 mL 1%對二氨基苯甲醛（用9 mol/L硫酸溶解），搖勻，避光反應(yīng)1 h，加入0.05 mL 0.2% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置30 min備用。以空白調(diào)零點，在595 nm波長下測定各溶液的吸光度。

1.2.2 樣品測定

稱取適量羊肚菌樣品，置25 mL消解管中，加5 mL 6 mol/L NaOH溶液，放入烘箱中110 ℃水解24 h，用超純水多次洗滌消解管，合并洗滌液抽濾，用4 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 6～8，定容至100 mL容量瓶。取2 mL上清液放入具塞試管中，加入5 mL 1%的對二氨基苯甲醛溶液，搖勻。另取2 mL上清液加入5 mL 9 mol/L H2SO4液作樣品空白，搖勻，室溫放置1 h。向每支試管加入0.05 mL 0.2% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置30 min。以樣品空白調(diào)零點，在595 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，計算即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以L-色氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，采用Office Excel繪制標準曲線，見圖1。其線性關(guān)系為Y=0.584X-0.021（R2=0.998）。

圖1 色氨酸標準曲線

2.2 樣品測定結(jié)果

如表1所示，ST和FK這2份樣品中色氨酸的含量分別為0.53 g/100 g和0.59 g/100 g。與四川產(chǎn)羊肚菌[17]、云南產(chǎn)羊肚菌[18]相比，其色氨酸的含量略高。

表1 樣品測定結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗

取6份ST和FK樣品，按照1.2.2的步驟消解、顯色，依次測定吸光度，計算得到ST和FK中色氨酸含量平均為0.52 g/100 g和0.57 g/100 g，δRSD為0.66%和1.58%，說明試驗方法重復(fù)性良好。

2.4 精密度試驗

對每個樣品進行6次重復(fù)測定，做精密度試驗，結(jié)果如表2所示。

ST和FK中色氨酸含量分別為0.53 g/100 g和0.59 g/100 g，測定結(jié)果的相對標準偏差δRSD（n=6）分別為1.59%和1.74%，說明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗（n=6）

2.5 回收率試驗

取3組ST樣品，每組6份，分別向每組加入0.2，0.4和0.8 mLL-色氨酸對照品溶液。測其吸光度，回收率結(jié)果見表3所示。

3個不同添加水平的平均回收率分別為103.5%，102.98%和97.79%，說明試驗方法測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表3 回收率試驗

3 結(jié)論

采用6 mol/L NaOH溶液在110 ℃條件下對羊肚菌消解24 h，加入5 mL 1%對二氨基苯甲醛（用9 mol/L硫酸溶解），搖勻，避光反應(yīng)1 h，加入0.05 mL 0.2%NaNO2溶液，搖勻，室溫放置30 min，在595 nm波長下測其吸光度。測得ST和FK中色氨酸的含量分別為0.53 g/100 g和0.59 g/100 g。色氨酸的δRSD為1.59%～1.74%，平均回收率為97.79%～103.5%。

采用對二氨基苯甲醛比色法測定羊肚菌中的色氨酸，方法所需儀器簡單，操作方便，靈敏度較高，測定結(jié)果準確，可用于食用菌中色氨酸含量的測定。