山莓莖抗氧化及抑制亞硝化作用

謝華松，楊澤森，魏愛紅, ，朱銓娣，莊遠(yuǎn)杯, ，張聲源, *

1. 嘉應(yīng)學(xué)院（梅州 514031）；2. 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（梅州 514031）；3. 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所（梅州 514031）

各種自由基所引發(fā)的氧化損傷是導(dǎo)致體內(nèi)各組織器官損傷、病變的重要原因之一，人類許多重大疾病如糖尿病、癌癥、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、動(dòng)脈粥樣硬化等均與由自由基引起的氧化損傷密切相關(guān)[1-2]。亞硝胺的前體物質(zhì)亞硝酸鹽和胺類大量存在腌制食物中，這些前體物質(zhì)在胃液酸性條件下極易轉(zhuǎn)化為亞硝胺，亞硝胺、苯并芘和黃曲霉素是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)[3]。研究表明，天然植物中的黃酮、多糖、有機(jī)酸、酚類等成分均具有良好的抗氧化活性和抑制亞硝化作用[4-5]。尋找安全有效、新型、天然的抗氧化及抑制亞硝化活性成分成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，對(duì)食品藥品行業(yè)具有重要意義。

山莓（Rubus corchorifolius）是薔薇科懸鉤子屬植物，也叫作龍船泡、牛奶泡、懸鉤子、泡兒刺、三月泡、樹莓等，廣泛分布在中國(guó)除東北三省、內(nèi)蒙古、新疆、西藏以外的其他各省、市、自治區(qū)，在海拔300～1 500 m的向陽(yáng)山坡、溪邊、山谷、荒地和灌木叢中生長(zhǎng)[6-8]。在中國(guó)，山莓作為藥用植物有悠久的用藥歷史，《本草綱目》《本草拾遺》《食療本草》《名醫(yī)別錄》等多部古代醫(yī)藥典籍里都詳細(xì)記載山莓的主要功效，且用藥部位不一，藥效也不盡相同[9]。山莓根性味微苦、辛、平，具有祛風(fēng)除濕的功效，主治風(fēng)濕腰痛、痢疾、白帶、小兒疳積等癥；葉性微苦，具有消腫解毒的功效，主治多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥；果性味微甘、酸、溫，具有澀精益腎、助陽(yáng)明目之功效，主治腎虛、遺精、遺尿等癥[8,10-11]。可見，山莓藥用部位不同時(shí)，其藥效不同，其潛在藥用價(jià)值較高。

山莓全株含黃酮類、鞣質(zhì)、香豆素化合物、酚性成分和皂苷等[6]，基于國(guó)內(nèi)外研究事實(shí)，推測(cè)山莓全株有潛在的抗氧化和抑制亞硝化活性，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)山莓莖抗氧化、抑制亞硝化活性研究少見報(bào)道。試驗(yàn)對(duì)山莓莖進(jìn)行抗氧化和抑制亞硝化活性評(píng)價(jià)，以期發(fā)現(xiàn)其抗氧化和抑制亞硝化活性最佳萃取部位，為山莓潛在的其他藥理作用及綜合開發(fā)利用提供參考價(jià)值和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物來源

山莓莖采自廣東省梅州市梅江區(qū)百歲山。

1.2 試劑

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯乙酸（C2HCl3O2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；對(duì)氨基苯磺酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水檸檬酸（C6H8O7，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸萘乙二胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素C（純度≥98%，西隴科學(xué)股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Q-Gard A2型超純水儀（德國(guó)Millipore公司）；BT125D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；BS110s型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；GL-25M型高速離心機(jī)（上海趙迪生物科技有限公司）；JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）；pHSJ-3F型pH計(jì)（上海精科儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 山莓莖不同極性萃取部位樣品的制備

將采摘處理后的山莓莖置于50 ℃烘箱干燥，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，稱取的質(zhì)量為642.51 g，按料液比1︰1（g/mL）加入無水乙醇超聲提取3次，合并提取液后減壓濃縮得到22.2 g乙醇提取物。取17.2 g乙醇提取物分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，收集各個(gè)有機(jī)層萃取液，進(jìn)行減壓濃縮，干燥，得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層4個(gè)不同極性萃取部位，儲(chǔ)存于冰箱，備用。

1.4.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)

此部分試驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外期刊曾報(bào)道的方法[12-14,17]。

1.4.2.1 DPPH法[12,17]

精密移取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品或VC溶液，分別加入1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，置于暗處，室溫反應(yīng)20 min，以無水乙醇溶劑做空白對(duì)照，測(cè)定其在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（Ai）；測(cè)定1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液與1.0 mL無水乙醇混合后在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（A0）；測(cè)定1.0 mL無水乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（Aj）。并根據(jù)式（1）計(jì)算出樣品和VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.4.2.2 ABTS法[13,17]

將7.0 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混合，置于暗處反應(yīng)12～16 h，制備得到ABTS工作液。ABTS工作液用10 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4）進(jìn)行稀釋，直到工作液在734 nm處吸光度為（0.70±0.02），避光室溫保存?zhèn)溆谩７謩e精密移取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液于試管中，各試管加入3.9 mL ABTS工作液，振蕩，于暗處室溫反應(yīng)10 min，測(cè)定其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度（Ai）。同法測(cè)定3.9 mL ABTS工作液與100 μL無水乙醇混合后在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度（A0），3.9 mL 10 mmol/L磷酸緩沖溶液與100 μL樣品溶液在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度（Aj）。根據(jù)公式計(jì)算出樣品和VC溶液對(duì)ABTS自由基的清除率。計(jì)算公式同式（1）。

1.4.2.3 普魯士藍(lán)法[14,17]

精密吸取2.5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品、2.5 mL的PBS緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2.5 mL K3Fe(CN)6溶液于10 mL試管中充分搖勻后，在50 ℃下恒溫水浴反應(yīng)20 min，急速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分搖勻后轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，在6 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液于試管中，依次加入2.0 mL蒸餾水與0.5 mL FeCl3溶液混合均勻。用不同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)上述操作，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)VC溶液濃度（μmol/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)結(jié)果表示為μmol VC/g（即鐵還原力大小用每克樣品的VC當(dāng)量表示）。

1.4.3 抑制亞硝化作用評(píng)價(jià)

此部分試驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)期刊曾報(bào)道的方法[15,17]。

1.4.3.1 鹽酸萘乙二胺法

精密吸取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品于25 mL具塞比色管中，分別依次加入2.0 mL pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，2.0 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，混勻。在37 ℃下水浴1 h，取出，加入2.0 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，混勻，靜置5 min后，各加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min后在538 nm下測(cè)定吸光度，同時(shí)用VC做對(duì)照試驗(yàn)。根據(jù)式（2）計(jì)算出樣品和VC溶液對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

式中：A0為空白反應(yīng)體系的吸光度；Ai為樣品反應(yīng)體系的吸光度。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析

采用Origin和SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。利用單因素方差分析和Duncan法檢驗(yàn)多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性，以p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。IC50值是指清除率50%時(shí)樣品所需要的質(zhì)量濃度，利用Origin軟件根據(jù)不同質(zhì)量濃度樣品溶液的清除率繪制曲線并對(duì)各曲線線性擬合，進(jìn)而求出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性結(jié)果

2.1.1 DPPH法

山莓莖各萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果見圖1。山莓莖不同極性萃取部位和VC清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增大，表現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。山莓莖各萃取部位的清除率在質(zhì)量濃度在0.001～0.050 mg/mL范圍內(nèi)增幅較大，乙酸乙酯層、正丁醇層和水層在質(zhì)量濃度0.050～0.200 mg/mL范圍對(duì)DPPH自由基的清除能力趨于平衡。與陽(yáng)性對(duì)照物VC對(duì)比，山莓莖各萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力均弱于VC。山莓莖各萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯層＞正丁醇層＞水層＞石油醚層。質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯層的清除率為85.14%，正丁醇層、水層和石油醚層分別為58.29%，43.48%和8.97%。

圖1 山莓莖對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

2.1.2 ABTS法

山莓莖清除ABTS自由基能力測(cè)定結(jié)果及IC50分別見圖2和表1。山莓莖不同極性萃取部位及VC的清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增大，表現(xiàn)出良好劑量依賴效應(yīng)。質(zhì)量濃度為0.025～0.050 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯層對(duì)ABTS自由基的清除能力趨勢(shì)大于VC，質(zhì)量濃度為0.050～0.080 mg/mL時(shí)，VC對(duì)ABTS自由基能力的清除趨勢(shì)大于山莓莖各萃取部位。山莓莖各萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除能力強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯層＞水層＞正丁醇層＞石油醚層。質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯層的清除率為88.30%，正丁醇層、水層、石油醚層分別為43.85%，51.22%和8.99%。

圖2 山莓莖各萃取部位及VC 對(duì)ABTS自由基的清除能力

表1 山莓莖各萃取部位和VC對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值（±s，n=3）

表1 山莓莖各萃取部位和VC對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值（±s，n=3）

注: 同豎肩標(biāo)字母不同表示差異顯著 (p＜0.05)。

樣品 IC50/(mg·mL-1)VC 0.083±0.000 55a石油醚層 0.766±0.034 0d乙酸乙酯層 0.090±0.001 8a正丁醇層 0.238±0.003 0c水層 0.199±0.001 7b

由表1可知，山莓莖各萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除能力存在顯著性差異（p＜0.05），乙酸乙酯層對(duì)ABTS自由基清除能力比石油醚層、正丁醇層和水層強(qiáng)，但山莓莖不同極性萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除能力均弱于VC。

2.1.3 普魯士藍(lán)法

VC對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定結(jié)果見圖3。以VC質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，得到回歸方程Y=36.768X-0.013 5，R2=0.998 7。根據(jù)山莓莖各萃取部位測(cè)出的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出鐵還原能力。

圖3 VC的鐵還原能力

山莓莖各萃取部位鐵還原能力的測(cè)定結(jié)果見圖4。正丁醇層的鐵還原能力最強(qiáng)，為（77.08±4.82）μmol VC/g，其次是乙酸乙酯層（57.89±4.32）μmol VC/g、水層（54.67±4.95）μmol VC/g和石油醚層（15.62±1.72）μmol VC/g，圖4中的字母不同表示差異顯著（p＜0.05），用單因素方差分析和Duncan法對(duì)山莓莖各萃取部位的鐵還原能力處理，結(jié)果顯示正丁醇層的鐵還原能力與VC、石油醚層及乙酸乙酯層存在顯著差異（p＜0.05），乙酸乙酯層的鐵還原能力與水層不存在顯著差異（p＞0.05）。

圖4 3個(gè)產(chǎn)地蓮霧果實(shí)的鐵還原能力

2.2 體外抑制亞硝化作用結(jié)果

2.2.1 鹽酸萘乙二胺法

山莓莖清除ABTS自由基能力測(cè)定結(jié)果及IC50分別見圖5和表2。在模擬人體胃液條件下，山莓莖不同極性萃取部位對(duì)亞硝酸鹽表現(xiàn)出一定程度的清除作用，且清除率在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增加而增加，表現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。乙酸乙酯層的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其對(duì)亞硝酸鹽的清除率為80.78%，正丁醇層、水層、石油醚層對(duì)亞硝酸鹽的清除率分別為69.03%，35.45%和16.18%。

圖5 山莓莖各萃取部位對(duì)亞硝酸鹽的清除率

表2 山莓莖各萃取部位及VC對(duì)亞硝酸鹽清除作用的IC50值（±s，n=3）

表2 山莓莖各萃取部位及VC對(duì)亞硝酸鹽清除作用的IC50值（±s，n=3）

注: 同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著 (p＜0.05)。

樣品 IC50/(mg·mL-1)VC 0.16±0.001 1a石油醚層 43.51±0.330e乙酸乙酯層 3.90±0.052b正丁醇層 6.28±0.074c水層 17.21±0.200d

由表2所示，山莓莖各萃取部位對(duì)亞硝酸鹽清除能力有顯著差異（p＜0.05），乙酸乙酯層清除亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，但山莓莖各極性部位其清除亞硝酸鹽的能力弱于VC（IC50=0.16±0.001 1 mg/mL）。

3 討論

采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍(lán)法3種方法對(duì)山莓莖不同極性萃取部位的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示在3種方法中，山莓莖不同極性萃取部位均呈現(xiàn)出不同程度的活性，其中乙酸乙酯層對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，正丁醇層的鐵還原力能力最強(qiáng)，但是在各個(gè)評(píng)價(jià)體系中抗氧化能力強(qiáng)弱卻存在差異，DPPH法的強(qiáng)弱順序?yàn)橐宜嵋阴樱菊〈紝樱舅畬樱臼兔褜?，ABTS法的強(qiáng)弱順序?yàn)橐宜嵋阴樱舅畬樱菊〈紝樱臼兔褜樱蒸斒克{(lán)法的強(qiáng)弱順序?yàn)檎〈紝樱疽宜嵋阴樱舅畬樱臼兔褜?，推測(cè)其中原因是抗氧化活性的3個(gè)評(píng)價(jià)方法的原理和作用機(jī)制不一樣。抑制亞硝化結(jié)果顯示，在模擬人體胃酸條件下，山莓莖不同極性萃取部位均具有一定的抑制亞硝化能力，乙酸乙酯層對(duì)亞硝酸鹽的清除能力最強(qiáng)，但乙酸乙酯層、水層、正丁醇層、石油醚層的抑制亞硝化能力均弱于陽(yáng)性對(duì)照品VC。在后續(xù)研究中可對(duì)乙酸乙酯層進(jìn)行分離提純以尋找抑制亞硝化作用活性成分。

4 結(jié)論

從天然植物中尋找具有抗氧化和抑制亞硝化作用的活性成分，是藥品食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。探究山莓莖4個(gè)不同極性萃取部位（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層）體外抗氧化、抑制亞硝化活性，由結(jié)果可知，山莓莖不同極性萃取部位均有抗氧化作用，乙酸乙酯層對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，正丁醇層的鐵還原力能力最強(qiáng)；山莓莖各極性萃取部位均有抑制亞硝化作用，乙酸乙酯層是抑制亞硝化作用的最佳萃取部位。試驗(yàn)結(jié)果有助于闡明山莓莖藥食兩用科學(xué)內(nèi)涵，為山莓綜合開發(fā)利用提供參考價(jià)值。