水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白理化性質(zhì)的影響

馬瑩瑩，任仙娥*，李春枝，楊鋒，黃永春，閻柳娟

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室（柳州 545006）

大豆蛋白氨基酸組成合理，并具有良好的加工性能以及較低的成本，常作為重要的食品配料被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。大豆蛋白的主要成分為11S（大豆球蛋白）和7S（β-伴球蛋白），其中β-伴球蛋白是一種糖蛋白，具有三聚體的分子結(jié)構(gòu)，由α’-、α-和β-這3個亞基組成。大豆蛋白經(jīng)過適當(dāng)修飾改性后可獲得更好的功能性質(zhì)，滿足不同類型食品體系的需求[1]。蛋白質(zhì)改性方法有物理改性和化學(xué)改性等方法，物理改性是通過改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和分子間聚集方式使蛋白質(zhì)發(fā)生改性，具有無毒副作用、安全性高及對產(chǎn)品營養(yǎng)性質(zhì)影響較小等優(yōu)點而被廣泛使用?？栈夹g(shù)作為近些年應(yīng)用在食品加工中的新的物理方法，引起國內(nèi)外很多學(xué)者的關(guān)注。

水力空化作為一種新興技術(shù)，具有和超聲空化相似的空化效應(yīng)，在食品蛋白方面已有很多學(xué)者研究。Gregersen等[2]、Li等[3]的研究表明水力空化技術(shù)可降低牛奶蛋白濃縮物黏度，從而提高噴霧干燥效率，降低乳制品粉末的生產(chǎn)成本。Meletharayil等[4]研究發(fā)現(xiàn)水力空化可改善希臘酸奶的流變特性和微觀結(jié)構(gòu)。Pathania等[5]發(fā)現(xiàn)水力空化提高難以溶解的高蛋白奶粉再水化性能。可見，水力空化技術(shù)在一定條件下能改變食品蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，進(jìn)而改善其產(chǎn)品品質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)單孔孔板水力空化可使大豆球蛋白的平均粒徑、暴露巰基含量和總巰基含量均減小，Zeta電位絕對值和表面疏水性均增加[6]。試驗進(jìn)一步研究水力空化處理對大豆蛋白中另一組分——大豆β-伴球蛋白理化性質(zhì)的影響，為該技術(shù)應(yīng)用于大豆蛋白改性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕（益海嘉里（防城港）有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉，西隴化工股份有限公司）；1-苯胺-8-萘磺酸（ANS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；5, 5’二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB，國藥集團(tuán)化工試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；福林酚（上海源葉生物有限公司）。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；F97Pro型熒光分光光度計（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Nano ZS90馬爾文納米粒度和Zeta電位分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；T25高剪切混合乳化機(jī)（上海鑫鯊機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆β-伴球蛋白的制備

參照Nagano等[7]的方法稍作修改。脫脂豆粕經(jīng)過粉碎后，用0.180 mm直徑的篩子過篩，得到脫脂大豆粉。稱取120 g豆粕粉并將其充分溶解于1.8 L去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至8.0。室溫低速攪拌2 h，離心（9 000g，10 min，4 ℃）棄沉淀，保留上清液。向上清液中加入NaHSO3（0.01 mol/L），充分溶解后用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 6.4。將所得料液放置于4 ℃的冰箱內(nèi)冷藏，靜置過夜后離心（9 000g，10 min，4 ℃），得沉淀大豆球蛋白（11S），向上清液中加入CaCl2固體（0.01 mol/L），充分溶解后用2 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至5.0。將調(diào)好后的料液放入已加熱至45 ℃水浴鍋中靜置保溫30 min，保溫結(jié)束后將料液溫度降至25 ℃左右，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 5.5。離心（9 000g，10 min，4 ℃）取上清液，上清液加等體積的去離子水（體積比1︰1），攪拌均勻后用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 4.8。在室溫下靜置2 h后離心（6 500g，10 min，4 ℃），所得沉淀即為大豆β-伴球蛋白。向大豆β-伴球蛋白沉淀中加入少量去離子水溶解，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.0，充分?jǐn)嚢枞芙?。裝入經(jīng)過處理的透析袋中，放于4 ℃冰箱透析48 h，透析液經(jīng)真空冷凍干燥后裝入密封袋，放置冰箱凍藏備用。

1.3.2 水力空化處理不同pH大豆β-伴球蛋白

將大豆β-伴球蛋白配成4份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的分散液于1 000 mL燒杯中，分別調(diào)pH至3，5，7和9，取800 mL倒入水力空化裝置的貯罐中，空化裝置圖同文獻(xiàn)[6]，啟動裝置，開啟冷凝水使大豆β-伴球蛋白在整個處理過程中溫度不超過35 ℃，處理不同時間（0，10和30 min）后取樣測定其理化指標(biāo)，每個指標(biāo)測3次。

1.3.3 粒徑和Zeta電位的測定

將空化處理后的蛋白質(zhì)離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃）后稀釋至3 mg/mL，用0.45 μm的濾膜在室溫下采用納米粒度儀測定各樣品的粒徑。再取樣品測定其Zeta電位。測定條件：1 cm聚苯乙烯池，一對0.45 cm2鉑電極，間距0.4 cm，測定溫度25 ℃，平衡時間2 min。

1.3.4 表面疏水性的測定

參照Voutsinas等[8]的方法，以ANS為熒光探針，將蛋白樣品用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.005～0.5 mg/mL），取4 mL樣品，加入10 μL 8 mmol/L ANS溶液，混合均勻后，在熒光分光光度計下進(jìn)行測定。設(shè)定激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長490 nm、狹縫寬5 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度作圖并進(jìn)行線性回歸，以線性回歸斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

1.3.5 乳化性的測定

參考楊盛楠等[9]方法稍作修改。將蛋白樣品稀釋至3 mg/mL，取15 mL蛋白溶液，加入5 mL玉米油，在試管中加入5 mL的1 mg/mL的SDS備用，將蛋白溶液在均質(zhì)機(jī)下進(jìn)行均質(zhì)分散1 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min。均質(zhì)停止時直接從底部吸取50 μL的乳濁液加入到裝有SDS溶液的試管中，并將其充分混勻。靜置10 min之后再從均質(zhì)后的樣液的底部吸取50 μL加入到另一支裝有SDS溶液的試管中，使用紫外可見分光光度計在500 nm處測定吸光度。靜置前后所測得的吸光度用A0、A10表示。以SDS溶液作為空白對照。乳化活性指數(shù)（EAI，m2/g）和乳化穩(wěn)定性（ESI，min）分別按式（1）和（2）計算。

式中：θ為用于形成乳液所用油相在溶液中所占體積比；C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；L為比色皿的厚度；DF為稀釋倍數(shù)；A0為均質(zhì)停止時取樣測定的吸光度；A10為靜置10 min后取樣測定的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑分布

大豆β-伴球蛋白在不同pH下的粒徑分布如圖1（A）所示。在所試pH下均呈多峰分布，其中在pH 5時有4個峰，1～100 nm處現(xiàn)3個峰，100～1 000 nm處1個峰；pH 3時有3個峰，分別在10～100，100～1 000和1 000～10 000 nm；pH 7和9時呈雙峰分布。由圖2可知，在pH 5時，平均粒徑最大，為213.07±4.24 nm；pH 7和9時，平均粒徑較小，分別為（18.30±4.41）nm和（15.11±0.22）nm。因為在溶液pH接近等電點（pI=4.8）時，分子間靜電斥力降低，發(fā)生聚集，所以平均粒徑較高。

由圖1（B）可知，大豆β-伴球蛋白在pH 3時，水力空化處理后1 000～10 000 nm處的峰消失，10～100 nm處的峰向左偏移。pH 5時，處理后的粒徑分布如圖1（C）所示，100～1 000 nm處的峰均向左偏移，且處理30 min后在1 000～10 000 nm出現(xiàn)一個峰。從圖1（D）中可知，pH 7時水力空化處理對蛋白的粒徑分布無影響。pH 9時粒徑分布圖如1（E）所示，經(jīng)水力空化處理后10～100 nm處的峰強(qiáng)度增加，粒徑分布變窄。由圖2可知，pH 5時，其平均粒徑隨空化處理時間顯著減?。╬＜0.05），處理30 min后蛋白的平均粒徑從（213.067±4.25）nm減小到（96.9±0.74）nm，這可能是由于空化效應(yīng)，產(chǎn)生湍流和高剪切力，破壞蛋白分子間相互作用，大豆β-伴球蛋白的大聚集體逐漸被解離成小聚集體，從而導(dǎo)致平均粒徑顯著減小。王芳等[6]的研究結(jié)果表明單孔孔板水力空化處理可顯著降低大豆球蛋白的平均粒徑，處理30 min后大豆球蛋白的平均粒徑由（335.67±3.43）nm減小至（234.73±4.32）nm。Hu等[10]的研究結(jié)果表明高強(qiáng)度超聲處理40 min，7S球蛋白的平均粒徑從75.9 nm減小到51.8 nm。由此說明水力空化和超聲空化等物理改性具有相似的效果，均能引起蛋白質(zhì)分子中聚集體的解離，從而導(dǎo)致其平均粒徑減小。而在pH 3，7和9時，水力空化處理并未引起大豆β-伴球蛋白平均粒徑發(fā)生顯著變化（p＞0.05）。

圖1 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白粒徑分布的影響

2.2 Zeta電位

蛋白質(zhì)的Zeta電位可以通過蛋白質(zhì)表面電荷的分布來體現(xiàn)[11]。通常，蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時，其Zeta電位為負(fù)值，反之則為正值。Zeta電位的絕對值越大，表明體系越穩(wěn)定[12]。由圖3可知，pH 3時，電位為正值，說明在酸性條件下蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸多于帶負(fù)電荷的氨基酸。pH 5，7和9時電位為負(fù)值，且隨著pH的增加電位絕對值增大。

大豆β-伴球蛋白經(jīng)水力空化處理后，其Zeta電位絕對值在pH 3和7時減小，pH 5和9時顯著增加（p＜0.05）。Zeta電位絕對值增加可能是經(jīng)孔板水力空化處理后，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)在一定程度上被破壞，分子展開帶負(fù)電荷的氨基酸殘基更多被暴露于蛋白分子表面而導(dǎo)致的。pH 5時平均粒徑減?。▓D2），聚集體發(fā)生解聚，更多帶負(fù)電荷的氨基酸殘基暴露出來，也使Zeta電位絕對值增加。Zeta電位絕對值減小是因為在pH 3和7時，經(jīng)水力空化處理后蛋白發(fā)生輕微聚集，帶電荷的基團(tuán)被掩埋導(dǎo)致Zeta電位絕對值減小?？梢?，水力空化處理后大豆β-伴球蛋白分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。

圖2 水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白平均粒徑的影響

圖3 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白Zeta電位的影響

2.3 表面疏水性

表面疏水性是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)之一[13]，其大小是由疏水性基團(tuán)暴露的程度決定的。如圖4所示，pH 5時，表面疏水性最低（456.35±16.81），這是因為大豆β-伴球蛋白在疏水相互作用下形成聚集體，圖2中pH 5時蛋白平均粒徑最大也可印證這點。在pH＞pI與pH＜pI時，大豆β-伴球蛋白的表面疏水性均顯著增加（p＜0.05），且pH 3時達(dá)到最大（1 944.71±150.16），說明遠(yuǎn)離等電點時埋藏在蛋白分子內(nèi)的疏水基團(tuán)暴露出來，使表面疏水性增加。

大豆β-伴球蛋白在pH 3和9時經(jīng)水力空化處理后，表面疏水性無顯著變化（p＞0.05），說明在pH 3和9時經(jīng)水力空化處理后暴露到蛋白質(zhì)表面的疏水性基團(tuán)無明顯變化，從圖2也知pH 3和9的平均粒徑無顯著變化（p＞0.05）。pH 5和7時，水力空化處理10 min后表面疏水性顯著增加（p＜0.05），說明有較多的疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加。這可能是因為空化泡潰滅的瞬間產(chǎn)生高溫、高壓和高剪切力等，破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)或者使大的聚集體解聚，導(dǎo)致蛋白分子之間形成的聚集體較少（圖2中平均粒徑減小可印證），進(jìn)一步暴露出包埋在β-伴大豆球蛋白分子中的疏水殘基。圖3中電位的絕對值增加也說明聚集體發(fā)生解離后更多疏水性殘基暴露，導(dǎo)致表面疏水性增加。

圖4 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白表面疏水性的影響

2.4 乳化性

評價蛋白質(zhì)乳化性的方法有乳化活性和乳化穩(wěn)定性等方法。水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響如圖5所示。由圖5（A）可知，大豆β-伴球蛋白在pH 5時乳化活性較小，為（7.52±0.41）m2/g，遠(yuǎn)離等電點呈上升趨勢，這與表面疏水性變化趨勢一致（圖4）。這是因為在等電點附近蛋白平均粒徑最大（圖2），表面疏水性較低（圖4），蛋白難溶且靜電斥力減小，所以乳化活性較差，遠(yuǎn)離等電點蛋白大的聚集體發(fā)生部分解聚，粒徑減小，疏水性基團(tuán)暴露出來，蛋白親油性增強(qiáng)，宏觀表現(xiàn)為乳化活性升高[14]。

由圖5（A）可知，大豆β-伴球蛋白的乳化活性在pH 5，7和9時隨水力空化處理時間的延長而增加，在pH 7空化時間為30 min時達(dá)到最大（95.48±0.82 m2/g）。這是因為水力空化產(chǎn)生的空化效應(yīng)使蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白分子的極性親水基團(tuán)與非極性疏水基團(tuán)暴露出來，親水性與親油性均增強(qiáng)，親水性與親油性達(dá)到一定程度的平衡時，蛋白質(zhì)在油水界面具有較好的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為乳化活性增強(qiáng)[15]。從圖5（B）中可見，大豆β-伴球蛋白經(jīng)水力空化處理后乳化穩(wěn)定性在pH 3和5時呈下降趨勢，而在pH 7空化10 min與pH 9空化30 min后乳化穩(wěn)定性增大。pH 3時的乳化穩(wěn)定性較低，可能是此時的蛋白質(zhì)粒徑比堿性條件下的粒徑大，粒子分布不均勻，導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。

圖5 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化性的影響

3 結(jié)論

大豆β-伴球蛋白的平均粒徑、Zeta電位、表面疏水性和乳化性等理化性質(zhì)隨著pH的改變而不同。水力空化處理在試驗所試pH下均可使其理化性質(zhì)發(fā)生變化，變化程度與其所處的pH有關(guān)，以pH 5和7時較為明顯?？梢姡栈瘏f(xié)同pH處理對大豆β-伴球蛋白的改性具有一定效果，這對將水力空化技術(shù)應(yīng)用到大豆蛋白的生產(chǎn)中有一定意義。關(guān)于水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及起泡性、凝膠性等功能性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。