甘蔗原汁乳酸發(fā)酵飲料的工藝

徐勇士 ，魏勃，魏甜甜，葛艷靜，孫帥楠，杭方學 *

1. 廣西大學糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心（南寧 530004）；2. 廣西制糖學會（南寧 530004）；3. 廣西百桂堂食品科技有限公司（貴港 537121）；4. 廣西大學輕工與食品工程學院（南寧 530004）

甘蔗是一種多年生熱帶和亞熱帶植物，屬單子葉植物綱、禾本科、黍亞科、蜀黍族、甘蔗亞族、甘蔗屬[1]，是一種能高效地將太陽能轉(zhuǎn)化為化學能C4植物[2]。甘蔗原產(chǎn)于熱帶新幾內(nèi)亞或印度，現(xiàn)廣泛種植在33°N和30°S之間[3]。我國是世界甘蔗種植第四大國，位于巴西、印度和泰國之后，種植面積在140萬hm2以上，年產(chǎn)甘蔗超過10 000萬 t[4-5]。甘蔗含有多種對人體新陳代謝有益的鐵、鈣、鉀、鈉、硒等微量元素[6-7]，以及蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素[8]、多酚類[9]、多糖類[10]、單糖[11]、黃酮類[12]、二十八烷醇[13]等營養(yǎng)物質(zhì)，具有清熱、生津、下氣、潤肺等作用[14]。

發(fā)酵飲料是果蔬、谷物等發(fā)酵原料經(jīng)過酵母菌、乳酸菌等微生物發(fā)酵配制而成的飲料產(chǎn)品[15]。微生物發(fā)酵過程中，大分子物質(zhì)被降解，發(fā)生代謝合成和生物轉(zhuǎn)化等一系列反應(yīng)，不但賦予了飲料新鮮獨特的風味和口感，還產(chǎn)生大量對人體健康有益的產(chǎn)物，如有機酸、酶類、維生素、氨基酸、多糖、低聚糖、酚類等[16]，近年來深受消費者青睞。

試驗以甘蔗為原料，采用酵母菌和乳酸菌二步發(fā)酵，在單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化方法，生產(chǎn)甘蔗原汁乳酸發(fā)酵飲料，以期為甘蔗的多元化加工和甘蔗乳酸發(fā)酵飲料的規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗（廣西百桂堂食品科技有限公司）；果酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；乳酸菌（實驗室保藏）；重鉻酸鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；D-果糖標品（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；蔗糖標品（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；D-無水葡萄糖（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；1114型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（紹興市滬越科學實驗儀器廠）；722N型可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；萬用電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；WAY.2S型數(shù)字阿貝折射儀（上海物理光學儀器有限公司）；DC-1015節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；pH計FE22（梅特勒-托利多上海有限公司）；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）；AcantiJ-E多用途高效離心機（美國貝克曼庫爾有限公司）；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 工藝流程及部分操作要點

酵母菌活化：稱取2 g果酒酵母，加入20 mL已滅菌4%葡萄糖溶液中，輕輕晃動并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min，完成活化。

乳酸菌活化：將乳酸菌接種到液體培養(yǎng)基上37 ℃活化培養(yǎng)24 h，傳代1次；取一定量乳酸菌液到一級種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，作為一級種子；按5%的體積比將一級種子接種到二級種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，作為二級種子。

1.4 酵母菌發(fā)酵工藝試驗

選取發(fā)酵溫度、酵母菌接種量以及發(fā)酵時間3個因素，以酒精度和殘?zhí)橇繛榭疾熘笜?，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法，確定酵母菌發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗因素及水平見表1。

表1 酵母菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗因素及水平

1.5 乳酸菌發(fā)酵工藝試驗

選取發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量以及發(fā)酵時間3個因素，以發(fā)酵液的pH和乳酸含量為考察指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法，確定乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗因素及水平見表2。

表2 乳酸菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗因素及水平

1.6 測定方法

酒精含量測定：參照參考文獻[17]的方法進行測定。

乳酸含量測定：采用酸堿滴定法測定。

糖含量測定：采用液相色譜法測定。色譜參數(shù)：流動相采用乙腈和超純水（V（乙腈）：V（水）= 75：25）的混合溶液，其流動相流速為1.0 mL·min-1。色譜柱，依利特Hypersil NH2柱5 mm（4.6 mm×250 mm）；柱溫，35 ℃；進樣量，10 mL；洗脫時間，15 min；采用示差檢測器，檢測溫度35 ℃。

總酚含量測定：參照參考文獻[18]的方法進行測定。

總黃酮含量測定：參照參考文獻[19]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵工藝試驗

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，總糖和蔗糖含量均呈現(xiàn)出先下降后略有上升的趨勢，酒精度的變化則呈現(xiàn)出相反的趨勢，先上升后略有下降，在發(fā)酵溫度32 ℃時，總糖和蔗糖含量最低，分別為128.56和76.92 g·L-1，酒精度最高為2.68%，這種變化趨勢表明果酒酵母是消耗糖類物質(zhì)來生產(chǎn)酒精；在低于32 ℃時，果酒酵母的生長繁殖較慢，糖類物質(zhì)利用消耗慢，產(chǎn)酒精少；在高于32 ℃時，酵母新陳代謝增強，老化加快，不僅影響最終產(chǎn)品的風味和口感，過高的發(fā)酵速率還會導致糖類物質(zhì)無法被酵母充分轉(zhuǎn)化為酒精而生成其他副產(chǎn)物。綜合考慮，選擇30，32和34 ℃進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖1 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.1.2 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖2可以看出，當接種量在0.1%～0.5%之間時，接種量增加，總糖及蔗糖含量迅速下降，酒精度迅速上升；當接種量為0.5%時，酒精度達到最大值（2.75%）；當接種量超過0.5%時，隨著接種量的增加，總糖含量、蔗糖含量以及酒精度均呈現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是由于接種量過大，酵母自身繁殖需要大量的糖類物質(zhì)，用于發(fā)酵及自身代謝的量減少，導致酒精度反而降低；酵母菌的生長受到甘蔗原汁中營養(yǎng)物質(zhì)的限制，其死亡速率大于生長速率，活菌數(shù)逐漸減少，無氧發(fā)酵速率降低，最終導致發(fā)酵液中酒精度降低[20]；另外接種量大，還會增大最終產(chǎn)品的“酵母”味，產(chǎn)生不愉快的口感和氣味[21]。綜合以上考慮，選擇0.5%作為酵母菌發(fā)酵的最適接種量。

圖2 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.1.3 發(fā)酵時間對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖3可知，在發(fā)酵前22 h，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的總糖含量和蔗糖含量迅速下降，酒精度的快速上升，在這段時間，酵母菌菌體大量增殖，發(fā)酵液中氧氣含量減少，酵母菌無氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇的速率增加。發(fā)酵時間超過22 h后，酒精度、總糖含量和蔗糖含量變化趨于平穩(wěn)，可能是由于酵母菌進入衰退期，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，為防止酵母長時間發(fā)酵產(chǎn)生不良風味，選擇發(fā)酵時間22 h。

圖3 發(fā)酵時間對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.2 酵母菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.1.2.1 回歸模型與數(shù)據(jù)分析

以發(fā)酵液總糖含量為響應(yīng)值進行三因素（發(fā)酵溫度X1（℃）、發(fā)酵時間X2（h）、接種量X3（%））三水平響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表4。三個單因素進行擬合后得到的關(guān)于Y回歸方程為Y=98.39-1.51X1-4.81X2-16.34X3+5.85X1X2+3.21X1X3+4.97X2X3+16.11X12+8.39X22+18.98X32。失擬項p=0.085 7＞0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合較好。決定系數(shù)R2=0.972 1，說明試驗的3個因素能解釋響應(yīng)值變化的97.21%，模型擬合程度很高，可用于分析和預測甘蔗原汁的酵母菌發(fā)酵過程；方程中X3、X12、X32對Y影響極顯著；X2、X1X2、X22對Y影響顯著，表明試驗因子與響應(yīng)值是非線性關(guān)系，與二次項也有關(guān)。

表3 酵母菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面設(shè)計及響應(yīng)值

表4 酵母菌發(fā)酵工藝試驗方差分析

2.1.2.2 驗證試驗

響應(yīng)面試驗預測最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度31.95℃、接種量0.73%、發(fā)酵時間22.35 h，此時預測的總糖為94.64 g·L-1。為了方便操作，將工藝調(diào)整為發(fā)酵溫度32 ℃、接種量0.7%、發(fā)酵時間22.4 h。重復5組驗證試驗，實際測定的總糖為96.45 g·L-1，與預測值基本一致。

2.2 乳酸菌發(fā)酵試驗

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響

溫度是影響乳酸菌生長和代謝的主要環(huán)境因素。由圖4可知，在31～37 ℃范圍內(nèi)，乳酸含量與溫度呈正相關(guān)，溫度升高，乳酸含量增；超過37 ℃后，乳酸含量迅速下降，溫度較低，乳酸菌生長緩慢，產(chǎn)酸量較少；溫度較高，乳酸菌代謝旺盛，提早進入衰亡期，產(chǎn)酸量較少。pH的變化趨勢與乳酸含量相反，隨著溫度的上升而先迅速下降，當發(fā)酵溫度為37 ℃時，pH達到最低值，之后隨著發(fā)酵溫度的升高，pH緩慢升高。因此選定發(fā)酵溫度37 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響

2.2.1.2 接種量對乳酸菌發(fā)酵的影響

由圖5可知，接種量在1%～3%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，發(fā)酵液乳酸含量增加比較快，但接種量超過3%后，乳酸含量增加緩慢，可能是因為接種量過大，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分主要用于乳酸菌菌體的生長消耗。發(fā)酵液pH的變化與乳酸含量變化基本對應(yīng)，接種量1%～3%時，pH明顯下降，超過3%后緩慢下降。所以選擇接種量3%。

圖5 接種量對乳酸菌發(fā)酵的影響

2.2.1.3 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵的影響

由圖6可知，在發(fā)酵0～20 h時，發(fā)酵液中乳酸含量快速增加，pH迅速下降，可能是因為發(fā)酵初期營養(yǎng)成分較多，乳酸產(chǎn)量大；在20 h之后，乳酸含量變化很小，pH也趨于平穩(wěn)。發(fā)酵時間過短，乳酸積累不足，產(chǎn)品風味不好；發(fā)酵時間過長，營養(yǎng)成分大量減少，不利于乳酸菌生長代謝，開始進入衰退期。因此選定發(fā)酵時間20 h。

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.2.1 回歸模型與數(shù)據(jù)分析

以發(fā)酵液中乳酸含量為響應(yīng)值進行三因素（乳酸菌接種量X1（%）、發(fā)酵時間X2（h）、發(fā)酵溫度X3（℃））三水平響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

圖6 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵的影響

表5 乳酸菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面設(shè)計及響應(yīng)值

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表6。乳酸含量Y對乳酸菌接種量X1、發(fā)酵時間X2、發(fā)酵溫度X3的回歸方程為Y=6.60+0.36X1+0.022X2-0.20X3-0.15X1X2-0.088X1X3+0.18X2X3-0.68X12-0.47X22-1.04X3

2。

表6 乳酸菌發(fā)酵工藝試驗方差分析

失擬項p=0.558 5＞0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合較好。決定系數(shù)R2=0.989 0，說明試驗因素能解釋響應(yīng)值變化的98.90%，模型擬合程度很高，可用于分析和預測甘蔗原汁乳酸發(fā)酵飲料第二階段乳酸菌發(fā)酵過程。

2.2.2.2 驗證試驗

響應(yīng)面試驗預測第二階段乳酸菌發(fā)酵過程的最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度36.67 ℃、接種量3.56%、發(fā)酵時間19.84 h，此時乳酸含量為6.66 g·L-1。結(jié)合實際條件，將條件調(diào)整為發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.6%、發(fā)酵時間20 h。重復5組驗證試驗，實際測定的乳酸含量平均值為6.60 g·L-1，與理論值基本一致，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵條件是可行的。

2.3 發(fā)酵前后理化性質(zhì)的變化

由表7可知，pH、可溶性固形物和蔗糖含量在兩步發(fā)酵中均有降低，乳酸含量一直在增加，葡萄糖和果糖含量在酵母菌發(fā)酵階段增加，在乳酸菌發(fā)酵階段降低；可溶性固形物和蔗糖含量在酵母菌發(fā)酵階段，分別從18.1 °Bx和172.14 g·L-1降至11.2 °Bx和50.32 g·L-1，降幅很大，主要是由于酵母菌中的蔗糖酶把蔗糖分解成葡萄糖和果糖，與該階段葡萄糖和果糖含量增加對應(yīng)；在乳酸菌發(fā)酵階段，蔗糖含量從50.32 g·L-1降至49.00 g·L-1，僅降低了2.62%，而葡萄糖、果糖含量則從29.02 g·L-1和30.31 g·L-1降至10.56 g·L-1和19.93 g·L-1，分別下降了63.61%和34.25%，葡萄糖和果糖的消耗量明顯高于蔗糖消耗量，說明乳酸菌更傾向于利用葡萄糖和果糖作為碳源；蔗糖、果糖和葡萄糖3種糖總量在乳酸菌發(fā)酵前后分別為109.65和79.49 g·L-1，降低了27.51%，而可溶性固形物在乳酸發(fā)酵前后分別為11.2和9.6 °Bx，僅下降了14.29%，說明乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生了其他可溶性物質(zhì)，部分消除了由蔗糖、果糖和葡萄糖3種糖消耗引起的可溶性固形物的降低。

表7 甘蔗原汁發(fā)酵前后理化指標含量變化

2.4 發(fā)酵前后總酚和總黃酮的變化

由表8可知，總酚和總黃酮含量均為甘蔗原汁＜酵母菌發(fā)酵液＜發(fā)酵飲料，總酚含量依次是482.141，539.021和556.147 mg·L-1，甘蔗原汁發(fā)酵飲料總黃酮含量依次是35.102，38.405和49.036 mg·L-1；經(jīng)過二步發(fā)酵，甘蔗原汁發(fā)酵飲料中總酚和總黃酮含量均明顯升高，相比于甘蔗原汁分別增加了15.35%和39.70%。

表8 甘蔗原汁發(fā)酵前后總酚和總黃酮含量

3 結(jié)論

試驗以甘蔗為原料，經(jīng)壓榨提原汁，通過酵母菌發(fā)酵及乳酸菌發(fā)酵，生產(chǎn)甘蔗原汁發(fā)酵型乳酸飲料。在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行響應(yīng)面優(yōu)化，酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件為發(fā)酵溫32 ℃、接種量0.7%、發(fā)酵時間22.4 h；乳酸菌發(fā)酵最佳工藝條件為發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.6%、發(fā)酵時間20 h，得到的甘蔗飲料乳酸含量為6.60 g·L-1。經(jīng)二步發(fā)酵，甘蔗原汁發(fā)酵飲料總酚和總黃酮含量均有提高，分別增加了15.35%和39.70%；乳酸發(fā)酵甘蔗原汁飲料顏色金黃，氣味芳香，口味酸甜，口感醇厚。