α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同酶解葛根淀粉的工藝

陳曉鏑，廖明晰，彭凌*

西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（綿陽(yáng) 621010）

葛根又叫葛藤、甘葛、雞齊根等，屬豆科植物。其味甘，性凉，是中國(guó)藥食兩用的植物[1]。新鮮葛根含淀粉20%以上、蛋白質(zhì)2.1%、異黃酮類(lèi)物質(zhì)2%，以葛根素為主[2]；還有一些人體必需氨基酸和微量元素等。葛根中的葛根素對(duì)高血糖、高血壓、高血脂及心腦血管疾病有一定療效，另外還有防治骨質(zhì)疏松、抗氧化、抑制病原菌繁殖、保護(hù)心肌、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、預(yù)防更年期綜合征等功效[3]。試驗(yàn)對(duì)庫(kù)存葛根淀粉綜合應(yīng)用，以單因素與正交因素為基礎(chǔ)，探討其酶解工藝對(duì)其影響，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

葛根淀粉（綿陽(yáng)市山葛農(nóng)業(yè)科技有限公司）；液化酶（即α-淀粉酶，酶活力20 000 U/g，浙江一諾生物科技有限公司）；糖化酶（即β-淀粉酶，酶活力50 000 U/g，南京納滿生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)試劑

碳酸氫鈉、鹽酸、碘化鉀、無(wú)水硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉（四水）、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、碘（粒狀）、碘化鉀、葡萄糖（均為分析純）；檸檬酸（一水）、異抗壞血酸（均為食品級(jí)）。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；PHS-3C酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；UV752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；BSA223S電子天平（0.001 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；DHG-9145A電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；DL-1電子萬(wàn)用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；C21-FK2101多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）。

1.4 分析方法

1.4.1 糊化度的測(cè)定方法

采用碘呈色分析法快速測(cè)定糊化度。取出糊化液后立即于離心機(jī)中以5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水20 mL，加入0.05 mol/L的碘-碘化鉀溶液1 mL，加水定容至50 mL，以碘-碘化鉀溶液為空白，用分光光度計(jì)在575 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，即為其碘呈色度，用碘呈色度即可快速反映糊化度[4]。試驗(yàn)重復(fù)1次，作為重復(fù)組。

1.4.2 還原糖的測(cè)定方法[5]

采用GB 5009.7—2016的直接滴定法測(cè)定還原糖。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.4.2.1 標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液

分別吸取甲液與乙液5.0 mL于錐形瓶，加水10 mL，并加入幾顆玻璃珠，加熱至沸，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液趁熱迅速滴定，直至藍(lán)色剛好消失為滴定終點(diǎn)，平均3次取平均消耗的葡萄糖量，記為m，即每10 mL堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖質(zhì)量（mg）。

1.4.2.2 測(cè)定還原糖

吸取淀粉液化液上清液V1mL于250 mL容量瓶，緩慢加入乙酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，加水定容并混勻，靜置30 min后過(guò)濾，為待測(cè)樣液。以錐形瓶為反應(yīng)容器，吸取酒石酸銅甲液與乙液各5.0mL，水10 mL，加入玻璃珠，加熱至沸，以待測(cè)樣液趁熱迅速滴定直到藍(lán)色剛好消失，重復(fù)3次后記錄平均消耗量V（mL）。

1.4.2.3 計(jì)算公式

測(cè)得的還原糖質(zhì)量濃度按式（1）計(jì)算。

式中：X為液化液中還原糖質(zhì)量濃度，g/L或mg/mL；m為堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖質(zhì)量，mg；V1為吸取稀釋的液化液體積，mL；F為系數(shù)，試驗(yàn)取0.8；V為測(cè)定時(shí)平均消耗的待測(cè)液體積，mL；250為定容體積，mL；1 000為換算系數(shù)。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 糊化試驗(yàn)

葛根淀粉糊化時(shí)，在固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL，溫度65，70，75，80，85和90 ℃，時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0，pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5下水浴加熱。

1.5.2 液化試驗(yàn)

在α-淀粉酶用量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%，pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，時(shí)間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，溫度50，55，60，65，70和75 ℃下水浴加熱。

1.5.3 糖化試驗(yàn)

在β-淀粉酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%，pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0，時(shí)間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，溫度45，50，55，60，65和70 ℃下水浴加熱。

1.6 工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選出最佳水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出優(yōu)化工藝條件。

1.6.1 糊化工藝優(yōu)化

1.6.1.1 固液比

基于70 ℃、pH 8.0下水浴加熱1.5 h，通過(guò)設(shè)置固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL[6]，測(cè)定糊化度及觀察組織狀態(tài)，從而選取最佳3個(gè)水平。

1.6.1.2 pH

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃下水浴加熱1.5 h，通過(guò)設(shè)置pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5，測(cè)定相應(yīng)糊化度并觀察組織狀態(tài)，從而比較選取最佳3個(gè)水平。

1.6.1.3 加熱時(shí)間

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃、pH 8.0下水浴加熱，通過(guò)設(shè)置水浴加熱時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，測(cè)定相應(yīng)糊化度并觀察其組織狀態(tài)，比較并選取其中最優(yōu)3個(gè)水平。

1.6.1.4 加熱溫度

基于固液比1：16 g/mL、pH 8.0下水浴加熱1.5 h，通過(guò)設(shè)置水浴加熱溫度65，70，75，80，85和90℃，測(cè)定相應(yīng)糊化度并觀察其組織狀態(tài)，比較并選取其中最佳3個(gè)水平。

1.6.1.5 正交試驗(yàn)

以上述4個(gè)單因素試驗(yàn)得出其3個(gè)最優(yōu)水平，通過(guò)L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以糊化度及組織狀態(tài)為指標(biāo)，確定最佳糊化條件。4個(gè)因素分別為溫度（A）、固液比（B）、pH（C）、時(shí)間（D）。

表1 葛根淀粉糊化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.6.2 液化工藝優(yōu)化

經(jīng)預(yù)糊化后，通過(guò)測(cè)定不同淀粉酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH下的還原糖質(zhì)量濃度，優(yōu)選3個(gè)最佳水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)得出最佳液化工藝條件。

1.6.2.1α-淀粉酶用量

基于pH 7.5、60 ℃下水浴加熱1 h，設(shè)置酶用量梯度0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%[8]，通過(guò)測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度選取最佳3個(gè)水平。

1.6.2.2 pH

基于酶用量0.15%、60 ℃下水浴加熱1 h，設(shè)置pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0[9]，通過(guò)測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度選取最佳3個(gè)水平。

1.6.2.3 酶解時(shí)間

基于酶用量0.15%、pH 7.5、60 ℃下水浴加熱，設(shè)置加熱時(shí)間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[10]，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，測(cè)定并選取最佳3個(gè)水平。

1.6.2.4 酶解溫度

基于酶用量0.15%、pH 7.5下水浴加熱1 h，設(shè)置溫度50，55，60，65，70和75 ℃，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，測(cè)定并選取最佳3個(gè)水平。

1.6.2.5 正交試驗(yàn)

通過(guò)L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定其最佳液化條件。選取4個(gè)因素分別是酶用量（A）、pH（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D），結(jié)合最佳液化的3個(gè)水平，制定得其四因素三水平表，如表2所示。

表2 葛根淀粉液化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.6.3 糖化工藝優(yōu)化葛根淀粉經(jīng)糊化、液化之后，通過(guò)分析在不同糖化酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH下的還原糖質(zhì)量濃度，確定正交優(yōu)化試驗(yàn)，得出最佳糖化工藝條件。

1.6.3.1β-淀粉酶用量

基于pH 5.0、55 ℃下水浴加熱1 h，設(shè)置酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%[12]，通過(guò)測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度選取最佳3個(gè)水平。

1.6.3.2 pH

基于酶用量1.2%、55 ℃下水浴加熱1 h，設(shè)置pH3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0[13]，通過(guò)測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度選取最佳3個(gè)水平。

1.6.3.3 酶解時(shí)間

基于酶用量1.2%、pH 5.0、55 ℃下水浴加熱，設(shè)置加熱時(shí)間梯度為0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[14]，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，測(cè)定并選取最佳3個(gè)水平。

1.6.3.4 酶解溫度

基于酶用量1.2%、pH 5.0下水浴加熱1 h，設(shè)置溫度梯度為45，50，55，60，65和70 ℃，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，測(cè)定并選取最佳3個(gè)水平。

1.6.3.5 正交試驗(yàn)

通過(guò)L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定其最佳糖化條件。選取4個(gè)因素分別是酶解溫度（A）、糖化酶用量（B）、pH（C）、酶解時(shí)間（D），制得四因素三水平表如表3所示。

表3 葛根淀粉糖化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

通過(guò)軟件Origin 7.5處理單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并作曲線圖；通過(guò)軟件SPSS 17.0進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根淀粉糊化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 糊化工藝優(yōu)化條件分析

從圖1a可見(jiàn)，隨著pH上升，糊化度逐漸升高，在pH 7.0左右變化較為平緩，pH 8.0以后逐漸穩(wěn)定。所以選取最佳的3個(gè)水平為pH 7.5，8.0和8.5。

從圖1b可見(jiàn)，溫度對(duì)糊化的影響很大。70 ℃開(kāi)始，糊化度迅速升高，85 ℃后逐漸平緩，所以選取最佳的3個(gè)水平為80，85和90 ℃。

從圖1c可見(jiàn)，糊化時(shí)間越長(zhǎng)，糊化度越高，糊化時(shí)間2.5 h后趨于極限。所以選取最佳的3個(gè)水平為2.0，2.5和3.0 h。

從圖1d可見(jiàn)，固液比1：20 g/mL時(shí)最高。固液比1：8到1：20 g/mL之間時(shí)，加水越多糊化度越高；固液比超過(guò)1：20 g/mL后，糊化度較緩慢地降低。所以選取最佳的3個(gè)水平為1：16，1：20和1：24 g/mL。

圖1 糊化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 糊化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

基于4個(gè)單因素試驗(yàn)選出較優(yōu)的3個(gè)水平做出的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

比較表4中各因素所對(duì)應(yīng)的極值可知，影響葛根淀粉糊化度的主次順序?yàn)闇囟龋ˋ）＞時(shí)間（D）＞固液比（B）＞pH（C）。正交試驗(yàn)優(yōu)選的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即在90 ℃，固液比1：20 g/mL，pH 7.5下水浴加熱3 h，可得最高糊化度，按最優(yōu)條件糊化后2次測(cè)定其糊化度為27.56%和27.98%。

表4 糊化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 葛根淀粉液化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 液化工藝優(yōu)化條件分析

由圖2a可知，酶用量越多還原糖質(zhì)量濃度越高，到0.25%趨于極限。故可以確定最佳3個(gè)水平為0.20%，0.25%和0.30%。

由圖2b可知，pH＜7.0時(shí)還原糖質(zhì)量濃度隨pH升高而升高，pH＞7.0時(shí)，隨pH升高而有所降低。在酸性環(huán)境下的液化效果不好，在pH 7左右比較合適。故選擇3個(gè)水平為6.5，7.0和7.5。

由圖2c可知，酶解1 h以內(nèi)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，還原糖質(zhì)量濃度越高。酶解1 h后還原糖質(zhì)量濃度基本趨平，故可以確定較優(yōu)3個(gè)水平為1.0，1.5和2.0 h。

由圖2d得出，溫度小于60 ℃時(shí)，隨著溫度升高，還原糖質(zhì)量濃度升高；溫度超過(guò)60 ℃后，還原糖質(zhì)量濃度趨于平緩。故可確定較優(yōu)3個(gè)水平為55，60和65 ℃。

圖2 液化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 液化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

基于4個(gè)單因素試驗(yàn)所選出較優(yōu)的3個(gè)水平做出的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 液化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5所示的各因素所對(duì)應(yīng)的極值可以看出，主次因素依次為時(shí)間（C）＞酶用量（A）＞溫度（D）＞pH（B），液化工藝最佳因素水平為A3B1C3D3，即在α-淀粉酶用量0.30%，pH 6.5，65 ℃下水浴加熱酶解2 h，其還原糖質(zhì)量濃度最高，按最優(yōu)條件液化后2次測(cè)定其還原糖質(zhì)量濃度為18.81和18.25 g/L。

2.3 葛根淀粉糖化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 糖化工藝優(yōu)化條件分析

由圖3a可以看出，還原糖質(zhì)量濃度與酶用量成正比，且影響很大。酶用量1.0%之后逐漸趨平，故可以確定3個(gè)較優(yōu)水平為1.0%，1.2%和1.5%。

由圖3b看出，pH 5.0時(shí)還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高，往兩側(cè)逐漸減小。故可以選擇出其最優(yōu)3個(gè)水平的pH為4.5，5.0和5.5。

從圖3c可以看出，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，還原糖質(zhì)量濃度越高，酶解時(shí)間1.5 h后逐漸趨于平緩。故可以篩選出較優(yōu)3個(gè)水平為1.0，1.5和2.0 h。

由圖3d可以看出，酶解溫度越高，還原糖質(zhì)量濃度越高，溫度超過(guò)60 ℃之后逐漸趨于平穩(wěn)。所以可以選出較優(yōu)3個(gè)水平為60，65和70 ℃。

圖3 糖化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 糖化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

基于4個(gè)單因素試驗(yàn)所選出較優(yōu)的3個(gè)水平，做出正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表6所示。

表6 糖化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表6所示的極差分析可以看出，主次因素依次為pH（C）＞時(shí)間（D）＞酶用量（B）＞溫度（A）。糖化工藝最佳因素水平為A2B2C1D2，即在65℃，β-淀粉酶用量1.20%，pH 4.5下水浴加熱酶解1.5 h，其還原糖質(zhì)量濃度最高，按最優(yōu)條件糖化后2次測(cè)定其還原糖質(zhì)量濃度為68.94和69.78 g/L。

3 結(jié)論

1) 最佳糊化工藝條件為固液比1：20 g/mL，pH 7.5，水浴加熱糊化溫度90 ℃，糊化時(shí)間3 h，可得到最佳葛根淀粉糊化液。

2) 最佳液化工藝條件為α-淀粉酶添加0.30%（以淀粉干基計(jì)），pH 6.5，水浴加熱酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間2 h，可得到最佳淀粉液化液。

3) 最佳糖化工藝條件為β-淀粉酶添加1.2%（以淀粉干基計(jì)），pH 4.5，水浴加熱酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間1.5 h，可得到最佳淀粉糖化液。