蘋果根皮苷微膠囊制備

徐穎，韓晶晶，董梅

1. 陜西科技大學食品與生物工程學院（西安 710021）；2. 渭南市食品藥品檢驗所（渭南 714000）

根皮苷的分子式是C21H24O10，相對分子質量為436.41，外觀為淡黃色的針狀結晶體。隨著人們對根皮苷的深入了解與研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)根皮苷具備抗氧化、保護心血管、改善記憶力、抗癌、減少血糖等很多的生理功用，在新型藥物的研究、保健食品的開發(fā)、化妝美容用品的研制等方面均具有普遍的使用前景[1-4]。有研究表明，蘋果多酚中多種活性物質，如根皮苷、綠原酸、兒茶素、槲皮素等均能起到降血糖的作用，但根皮苷在幾種物質中降血糖的效果最為顯著[5-7]。除了發(fā)現(xiàn)根皮苷在糖尿病醫(yī)治方面的功用，近些年還發(fā)現(xiàn)根皮苷對高血脂癥狀的動物具有降血脂的作用[8]。有研究表明，根皮苷能夠明顯降低體內(nèi)膽固醇的含量，這項研究又為根皮苷在醫(yī)學方面的應用開辟出了新的領域。此外，很多研究表明根皮苷能夠對多種植物體內(nèi)的病原菌起到抗性作用，比如火疫病、蘋果表面產(chǎn)生的黑星病等，其在植物的生長過程中發(fā)揮著明顯的作用[9-10]。此次試驗采用超聲波提取出蘋果中的根皮苷，復凝聚法與冷凍干燥相結合的方法進行微膠囊的制備。并對工藝進行優(yōu)化，使得根皮苷穩(wěn)定存在并進行應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣；根皮苷標準品（純度＞98%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司）；102型轉谷氨酰胺酶（一鳴精細化工有限公司）；其他均為實驗室常見試劑。

1.2 主要儀器和設備

FD5型冷凍干燥機（金西盟生物技術有限公司）；FA25型高速剪切乳化機（弗魯克流體機械制造有限公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（國華企業(yè)有限公司）；RE52CS-1型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮儀器廠）；其他均為實驗室常用儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 根皮苷標準曲線的建立

精確稱取80 mg的根皮苷標準品，用無水乙醇定容到50 mL容量瓶中，得1.6 g/L根皮苷標準溶液。分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL根皮苷標準溶液加到10 mL容量瓶中，之后再加入5 mL無水乙醇，用蒸餾水定容，充分搖勻后取其中1 mL于5 mL的容量瓶中加蒸餾水定容。取適量溶液倒于比色皿中于其最大吸收波長處測定吸光度，測定3個平行，取平均值。以根皮苷濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標作圖，擬合得到標準曲線的線性方程。

最大吸收波長的測定：在200～450 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，根據(jù)掃描結果可確定最大吸收波長284 nm，該波長與所查資料得到的根皮苷最大吸收波長相同，所得的標準曲線的線性方程為y=11.600 45x+0.002 89。

1.3.2 根皮苷提取量的計算

參考王敬等[11]的方法。準確稱取蘋果渣粉末進行提取，過濾后定容至50 mL容量瓶中，準確吸取一定體積濾液至10 mL的燒杯中，然后再往燒杯里面加入5 mL無水乙醇，然后將以上的溶液轉移至10 mL容量瓶里面，并在容量瓶里面加蒸餾水補充至刻度線，于最大吸收波長處測定吸光度，對應根皮苷標準曲線，計算得到稀釋液的濃度，按式（1）計算提取量。做3個平行，取平均值。

式中：C為稀釋液中根皮苷質量濃度，mg/mL；V為提取液用量，mL；W為蘋果渣粉末質量，g。

1.3.3 超聲波提取單因素試驗

用乙醇體積分數(shù)70%、提取時間2.5 h、料液比1：30（g/mL）、提取溫度65 ℃作為進行單因素篩選試驗的基礎條件。保持其中3個因素不變，只改變其中1個因素，得出該因素對根皮苷提取量的影響結果。

1.3.4 超聲波提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取溫度這4個因素進行正交試驗，每個因素選擇3個水平，依照L9(34)正交表安排試驗，見表1。

表1 因素水平表

1.3.5 微膠囊化工藝流程

將一定量的明膠與阿拉伯膠分別加入盛有適量蒸餾水的燒杯中，60 ℃下于恒溫加熱磁力攪拌器中溶解，待完全溶解后將2種溶液混合，直接在溫度還未降低時加入根皮苷，經(jīng)高速剪切機以10 000 r/min或更高的剪切速度剪切30 s以上，觀察其是否形成均勻乳狀液。之后倒入三口燒瓶中，在50 ℃水浴下用300 r/min的攪拌器攪拌，同時逐滴滴入10%的醋酸溶液降低pH至發(fā)生復合凝聚反應，一段時間后用所凍的碎冰將溫度降至15 ℃以下，加入10%的氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至6.0，隨后加入一定質量的轉谷氨酰胺酶固化2 h，在4 000 r/min離心力下離心5 min，除去上清液，隨即冷凍干燥得到固態(tài)微膠囊。

1.3.6 微膠囊化單因素試驗

設置基礎條件：明膠和阿拉伯膠1：1、攪拌速度300 r/min、芯壁比1：1、pH 4.0、壁材質量分數(shù)1.0%?？疾鞌嚢杷俣?、芯壁比、pH、壁材質量分數(shù)對根皮苷包埋率的影響。

1.3.7 微膠囊包埋的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以蘋果根皮苷微膠囊的包埋率為指標，選取攪拌速度、pH、攪拌速度、芯壁比設計四因素三水平的正交試驗，按照L9(34)正交表進行試驗，見表2。

表2 各因素水平表

2 結果與分析

2.1 超聲波提取的結果分析

2.1.1 超聲波提取單因素試驗的結果分析

2.1.1.1 乙醇體積分數(shù)對根皮苷提取量的影響

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)為75%時，根皮苷的提取量達到最大值；之后隨著乙醇體積分數(shù)的持續(xù)增大，根皮苷的提取量呈現(xiàn)下降趨勢，故確定75%為最佳的提取所用乙醇體積分數(shù)。在李愛民等[12]的研究中，通過單因素試驗得出提取時乙醇的最佳體積分數(shù)為70%，與此次試驗得到的75%為最佳體積分數(shù)基本符合，所以試驗得到的結果較為準確。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)下根皮苷的提取量

2.1.1.2 料液比對根皮苷提取量的影響

由圖2可知，隨著料液比的增大，根皮苷的提取量呈現(xiàn)上升趨勢，當料液比達到1：40（g/mL）時，提取量達到最大值，故選擇1：40（g/mL）為最佳的料液比。改變料液比主要是在于提取溶液對于所提取原料溶解性的改變，在料液比減小的過程中，溶液對于原料的溶解越來越好，所以在一定范圍內(nèi)提取率呈現(xiàn)增大的趨勢。所得到的折線圖符合事實，并與一些研究所得到的結果基本符合。

圖2 不同料液比下根皮苷的提取量

2.1.1.3 提取時間對根皮苷提取量的影響

由圖3可知，隨著提取時間的增加，根皮苷的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，并且當提取時間達到3.5 h時，根皮苷的提取量達到最大值，故得出3.5 h為最佳的提取時間。

圖3 不同提取時間下根皮苷的提取量

2.1.1.4 提取溫度對根皮苷提取量的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，根皮苷的提取量呈現(xiàn)出一直上升的趨勢。70 ℃后，增加溫度，根皮苷提取量上升的幅度很小，基本可以忽略不計，故確定最適提取溫度為70 ℃。

圖4 不同提取溫度下根皮苷的提取量

2.1.2 超聲波提取的正交試驗的結果分析

由表3可知，在正交試驗的條件下，單因素試驗選擇出的4個因素對根皮苷提取率的影響順序為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間。結合根皮苷提取率，最佳優(yōu)化結果為A3B2C1D3。經(jīng)過驗證，根皮苷提取量為14.60 mg/g。

表3 超聲波提取正交試驗結果

2.2 微膠囊化的結果分析

2.2.1 微膠囊單因素試驗的結果分析

2.2.1.1 最佳壁材質量分數(shù)的確定

如圖5所示，當壁材質量分數(shù)在0.5%～1.5%之內(nèi)時，蘋果根皮苷的包埋率呈現(xiàn)上升的趨勢；當壁材質量分數(shù)在1.5%～2.5%的范圍內(nèi)時，蘋果根皮苷的包埋率呈現(xiàn)下降趨勢。壁材質量分數(shù)較低時，所形成的微膠囊的外壁會很薄，會使得芯材外露。在一定的質量分數(shù)范圍內(nèi)，壁材濃度升高時，所形成的微膠囊的外壁會很厚，然后會使得微膠囊的穩(wěn)定性很好，可以更好地保護內(nèi)在的芯材。由圖5可知，1.5%的壁材質量分數(shù)為最佳的微膠囊化工藝參數(shù)。

圖5 不同壁材質量分數(shù)微膠囊的包埋率

2.2.1.2 最佳pH的確定

如圖6所示，隨著pH的增大，微膠囊的包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當pH為4時，微膠囊的包埋率達到最大值。pH對于包埋的影響很大，主要是因為包埋采用的是復凝聚法，只有達到復凝聚法反應的pH時，試驗才能夠更好地進行。阿拉伯膠本身帶有負電荷，明膠是兩性蛋白質，當pH＜4.8時，明膠才能夠帶上正電荷，在此基礎上才能夠和明膠發(fā)生反應。由圖6可知，pH 4是微膠囊包埋最佳的pH。

圖6 不同pH微膠囊的包埋率

2.2.1.3 最佳攪拌速度的確定

由圖7可知，當攪拌速度在100～300 r/min之間時，微膠囊的包埋率逐漸增大。當攪拌速度在300～500 r/min之間時，微膠囊的包埋率逐漸減小。故最佳的攪拌速度為300 r/min。

圖7 不同攪拌速度微膠囊的包埋率

2.2.1.4 最佳芯壁比的確定

由圖8可知，當芯壁比為1：1時，根皮苷的包埋率最高。當壁材比例較低時，復凝聚形成的外殼少，無法完全將根皮苷包裹起來，就會使得里面的芯材暴露出來。壁材占比較高時，形成的微膠囊也會更加穩(wěn)定。但是當芯壁比達到1：1后，再增加壁材的占比，包埋率不再增加，故確定最佳的芯壁比為1：1。

圖8 不同芯壁比微膠囊的包埋率

2.2.2 微膠囊正交試驗的結果分析

由表4可知，4個因素對于根皮苷的包埋率的影響順序為壁材濃度＞pH＞芯壁比＞攪拌速度。根據(jù)包埋率結果，最佳的微膠囊化試驗方案為A3B2C1D3。經(jīng)過驗證，包埋率為79.8%。

表4 微膠囊正交試驗結果表

3 討論

在微膠囊試驗過程中，用到了一種酶制劑——轉谷氨酰胺酶，該酶是一種較為常用的酶交聯(lián)劑，可以對作為壁材的明膠起到提高其凝膠性能的作用。該酶在包埋過程中所起到的作用類似于甲醛的固化作用：甲醛與明膠產(chǎn)生縮合反應，使明膠分子交聯(lián)后形成網(wǎng)狀結構，使得微膠囊的形狀不可逆。之所以不用甲醛作為固化劑而選擇轉谷氨酰胺酶，主要是考慮到它綠色環(huán)保的特點，并且微生物發(fā)酵法制備轉谷氨酰胺酶的技術越來越完善，酶的利用成本也逐漸降低[13]。轉谷氨酰胺酶能夠催化酰基轉移，利于蛋白質的交聯(lián)，其不依賴于Ca2+，能夠更好地應用于食品中[14]。除此之外，轉谷氨酰胺酶的交聯(lián)效果很好，形成的微膠囊的結構很穩(wěn)定[15]。

4 結論

試驗以蘋果渣根皮苷為研究對象，利用超聲波提取根皮苷，并進行單因素試驗探究乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間以及提取溫度對提取效果的影響。并且在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗，確定提取的最佳工藝。利用復凝聚法結合冷凍干燥技術制備微膠囊，并進行單因素試驗研究壁材濃度、pH、攪拌速度和芯壁比對包埋率的影響，之后采用正交試驗方法，達到確定最佳工藝條件的目的。結果表明，超聲波提取最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)80%、料液比1：40（g/mL）、提取時間3 h、提取溫度75 ℃。微膠囊化通過單因素試驗以及正交試驗，其最優(yōu)工藝為攪拌速度350 r/min、pH 4.5、芯壁比2：1、壁材的質量分數(shù)2.0%；在此條件下，包埋率為79.8%。