大孔樹(shù)脂純化縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A工藝

任志洋，唐凡淋，袁小紅*

西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（綿陽(yáng) 621000）

縱條紋炭角菌（Xylaria striataPat. 1887）為子囊菌門(mén)（Ascomycota）炭角菌科（Xylariaceae）炭角菌屬（XylariaHill ex Schrank）真菌，生長(zhǎng)范圍主要在腐朽樹(shù)皮和活樹(shù)根上[1]。前期對(duì)縱條紋炭角菌進(jìn)行多年研究，包括縱條紋炭角菌子實(shí)體的培養(yǎng)[1]、液體培養(yǎng)優(yōu)化[2-3]、子實(shí)體化學(xué)成分研究[4]及抗菌活性方案[5]、抗腫瘤活性[6]等，為縱條紋炭角菌的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。從炭角菌屬真菌的菌絲體中分離得到多種新穎的化合物，且證明其具有良好的生物活性[7]。環(huán)肽物質(zhì)因其特殊的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象關(guān)系[8]而具有較好的抗腫瘤、抗癌活性[9]，其在新藥開(kāi)發(fā)中得到了極大的重視。雷傳文[10]運(yùn)用多種色譜技術(shù)從縱條紋炭角菌中分離得到一種新的環(huán)肽Xylastriamide A，其作為一種新穎的環(huán)肽類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗腫瘤活性，并且對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)也有一定的抗蟲(chóng)活性，表明該環(huán)肽有著極大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

該類化合物傳統(tǒng)的分離方法[11]是通過(guò)一系列的色譜技術(shù)進(jìn)行純化，從而獲得單體物質(zhì)，該法步驟多且效率低，會(huì)耗費(fèi)大量的溶劑和時(shí)間，且固相吸附嚴(yán)重。為更好地對(duì)環(huán)肽Xylastriamide A進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)，有必要改良該環(huán)肽的分離純化過(guò)程，從而為該環(huán)肽的進(jìn)一步分析提供基礎(chǔ)保障。大孔吸附樹(shù)脂因其吸附效果好，操作簡(jiǎn)便，可反復(fù)使用的特性，被廣泛運(yùn)用于中藥材的有效成分富集及分離純化工藝中[12-13]。為很好地對(duì)環(huán)肽Xylastriamide A進(jìn)行分離，試驗(yàn)以縱條紋炭角菌為材料，采用不同型號(hào)、性能的樹(shù)脂對(duì)縱條紋炭角菌環(huán)肽進(jìn)行吸附、解吸試驗(yàn)，篩選出最適宜分離該環(huán)肽的樹(shù)脂，并對(duì)縱條紋炭角菌環(huán)肽分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到對(duì)環(huán)肽富集的效果，為縱條紋炭角菌的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

縱條紋炭角菌（2012年7月由賀新生教授采于西南科技大學(xué)楊樹(shù)樁，鑒定為炭角菌科炭角菌屬縱條紋炭角菌Xylaria striataPat. 1887）。

鹽酸（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；無(wú)水乙醇（分析純）；乙腈（色譜純）；超純水。

根據(jù)環(huán)肽Xylastriamide A的極性，故選擇不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂參數(shù)

1.1.2 儀器與設(shè)備

XJ-2小型提取濃縮機(jī)組（天津大明制藥設(shè)備廠）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260Infinity）；色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 縱條紋炭角菌粗提液制備

取縱條紋炭角菌子實(shí)體，粉碎過(guò)孔徑0.425 mm篩，按料液比1︰5（g/mL）加入90%乙醇在70 ℃下浸提3次，每次2 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏后，加入蒸餾水溶解，得到縱條紋炭角菌粗提液。

1.2.2 縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A含量測(cè)定

采用HPLC法，準(zhǔn)確稱取1 mg縱條紋炭角菌環(huán)肽Xylastriamide A標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈將其溶解，配成一系列的質(zhì)量濃度梯度溶液。按照流動(dòng)相采用乙腈-水（65︰35），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，等度洗脫的方式，在該條件下測(cè)定目標(biāo)物峰面積，以峰面積（Y）和環(huán)肽質(zhì)量濃度（X）作圖，得標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程為Y=32.789X+2.198 6（R2=0.999 6），線性關(guān)系良好。

1.2.3 大孔樹(shù)脂預(yù)處理[14]

將新購(gòu)買(mǎi)的大孔樹(shù)脂（H103、HP20、D101、AB-8）用無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜，使其充分溶脹，再濕法裝柱，用乙醇洗至流出液不渾濁為止，用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味。依次酸洗，用2 BV的5%鹽酸溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性；堿洗，用2 BV的2%氫氧化鈉溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性。備用。

1.2.4 大孔樹(shù)脂篩選

分別取預(yù)處理好的不同類型的大孔樹(shù)脂（AB-8、D101、HP20、H103）適量，用濾紙吸干水分后，各自稱取1 g于100 mL錐形瓶中，加入20 mL的縱條紋炭角菌粗提物，置于搖床中（25 ℃，120 r/min）靜態(tài)吸附24 h。各自取一定量上清液測(cè)定環(huán)肽Xylastriamide A濃度，按式（1）計(jì)算出各樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的吸附率。將大孔樹(shù)脂取出，用濾紙吸干表面提取液，加入100%乙醇20 mL進(jìn)行靜態(tài)解析，解吸液經(jīng)HPLC測(cè)定環(huán)肽含量并按式（2）計(jì)算各樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的解析率。

式中：E1為樹(shù)脂的吸附率，%；C0為吸附液中環(huán)肽的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余的環(huán)肽質(zhì)量濃度，mg/mL。

式中：E2為樹(shù)脂解吸率，%，C0為吸附液中環(huán)肽初始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余環(huán)肽質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中環(huán)肽質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.5 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附研究

取處理好的D101樹(shù)脂，用濾紙吸干水分，稱取1 g于100 mL錐形瓶中，加入20 mL的縱條紋炭角菌提取液，置于搖床中（25 ℃，120 r/min）靜態(tài)吸附24 h，并分別在1，2，3，4，6，8和12 h取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)，測(cè)定環(huán)肽Xylastriamide A含量，按式（3）測(cè)量吸附量，作吸附量-時(shí)間圖。

式中：Qc為樹(shù)脂的吸附量，mg/g；C0為吸附液中環(huán)肽的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余的環(huán)肽質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；M為樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.2.6 大孔樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化[15]

1.2.6.1 不同上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

取100 mL質(zhì)量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，改變上樣流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，柱體積（BV）為30mL，分別以1，2，3，4和5 BV/h的流速上柱吸附，收集流出液，計(jì)算吸附率。作吸附率-流速圖。

1.2.6.2 不同上樣濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

取4份3 mL質(zhì)量濃度100 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，分別加入297，97，57和39.8 mL用水制成1，3，5和7 mg/mL的混懸液，柱體積（BV）30 mL，流速2 BV/h，以不同質(zhì)量濃度上柱吸附，收集流出液，計(jì)算吸附率。作吸附率-質(zhì)量濃度圖。

1.2.6.3 不同上樣量對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

取質(zhì)量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，以2 BV/h的吸附流速上柱，每處理1 BV樣液（1 BV=30 mL）的流出液?jiǎn)为?dú)收集，測(cè)定流出液中的環(huán)肽Xylastriamide A濃度。流出液中該環(huán)肽質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液質(zhì)量濃度的10%時(shí)，確定樹(shù)脂的吸附已達(dá)到飽和[16]。作流出液質(zhì)量濃度-流出液體積圖。

1.2.7 大孔樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的動(dòng)態(tài)解吸條件優(yōu)化

1.2.7.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

取質(zhì)量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV（5份），分別以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計(jì)算吸附量，用3 BV的40%乙醇解吸，測(cè)定流出液中環(huán)肽Xylastriamide A含量，分別用60%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液進(jìn)行解吸，解吸流速為2 BV/h，收集解吸液，測(cè)定環(huán)肽Xylastriamide A濃度，計(jì)算解析率，比較不同體積分?jǐn)?shù)解吸劑對(duì)大孔樹(shù)脂解吸效果的影響。

1.2.7.2 洗脫劑量對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

取質(zhì)量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計(jì)算吸附量，用3 BV的40%乙醇洗去雜質(zhì)，用100%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，每1 BV單獨(dú)收集，測(cè)定環(huán)肽Xylastriamide A濃度。作流出液質(zhì)量濃度-洗脫液量體積圖。

1.2.8 純化工藝驗(yàn)證

取質(zhì)量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計(jì)算吸附量，用3BV的40%乙醇洗去雜質(zhì)，用3 BV的100%乙醇溶液進(jìn)行解吸。平行操作3次，按最佳工藝條件，通過(guò)HPLC分析大孔樹(shù)脂處理前后環(huán)肽Xylastriamide A占比。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

由表2可以看出，4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)縱條紋炭角菌中環(huán)肽的吸附和解吸效果不同。在這4種大孔樹(shù)脂中，HP20、D101、AB-8均對(duì)縱條紋炭角菌中環(huán)肽有著較好的吸附率和解析率，但D101的吸附率最大，解析率適中，且D101更加適合工業(yè)生產(chǎn)使用，因此，綜合考慮，選用D101作為純化縱條紋炭角菌中環(huán)肽的最佳樹(shù)脂。

表2 不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂篩選

2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖1可以看出，D101大孔樹(shù)脂在0～4 h之間，吸附量隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)急劇增加趨勢(shì)，為快速吸附階段；在4～6 h之間，吸附量增加不明顯，為慢速吸附階段；6 h以后，吸附量的變化不大，樹(shù)脂的吸附已經(jīng)接近飽和。故在實(shí)際應(yīng)用中，綜合考慮生產(chǎn)周期、效率等因素，上柱液靜態(tài)吸附最佳時(shí)間為6 h。

2.3 大孔樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.3.1 不同上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

由圖2可知，隨著上樣流速增加，環(huán)肽的吸附率不斷降低?？赡苁巧蠘恿魉佥^慢時(shí)，該環(huán)肽在柱中下降的速度較慢，有利于該環(huán)肽在樹(shù)脂內(nèi)的擴(kuò)散，讓樹(shù)脂與該環(huán)肽得以更加充分的接觸和吸附，上樣流速變快時(shí)，上樣液中的環(huán)肽成分未能充分的擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)就被沖出柱外，使樹(shù)脂對(duì)環(huán)肽的吸附率降低。對(duì)照?qǐng)D2，1和2 BV/h時(shí)均有較大的吸附率，綜合時(shí)間考慮，選擇2 BV/h為最佳上樣流速。

圖1 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 上樣流速對(duì)D101大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

2.3.2 不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

由圖3可知，D101樹(shù)脂吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度增加而降低，1 mg/mL時(shí)對(duì)應(yīng)的吸附率最大，這也符合低質(zhì)量濃度有利于吸附的原則。隨著上樣質(zhì)量濃度增加，吸附率下降程度逐漸增大，可能是上樣質(zhì)量濃度大時(shí)，環(huán)肽對(duì)于大孔樹(shù)脂的吸附存在競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)上樣質(zhì)量濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致大孔樹(shù)脂柱堵塞，影響使用。1和3 mg/mL的吸附率相差不大，綜合時(shí)間、效率考慮，選擇3 mg/mL為最佳上樣質(zhì)量濃度。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

2.3.3 不同上樣量對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

由圖4結(jié)果可以看出，隨著上樣量增加，流出液中環(huán)肽質(zhì)量濃度不斷增加，根據(jù)泄漏點(diǎn)的定義，上樣量7 BV時(shí)，此時(shí)的流出液中環(huán)肽質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液中環(huán)肽質(zhì)量濃度的10%，繼續(xù)增加上樣量，會(huì)使流出液環(huán)肽質(zhì)量濃度繼續(xù)增加。因此，優(yōu)選最佳上樣量為7 BV。

圖4 上樣量對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響

2.4 大孔樹(shù)脂對(duì)該環(huán)肽的動(dòng)態(tài)解吸條件優(yōu)化

2.4.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

由圖5可知，體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)，流出液中檢測(cè)不到環(huán)肽，說(shuō)明40%乙醇不能使目標(biāo)物洗脫，即可以用來(lái)除去雜質(zhì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，環(huán)肽開(kāi)始有少量泄露；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，解吸率也隨之提高，乙醇體積分?jǐn)?shù)100%時(shí)，解吸率最高。因此，優(yōu)選100%乙醇作為洗脫液。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

2.4.2 洗脫劑量對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

由圖6可知，洗脫液中環(huán)肽含量隨洗脫液增加而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，洗脫量達(dá)到3 BV時(shí)，流出液中環(huán)肽含量較低，此時(shí)環(huán)肽基本被洗脫，因此最佳洗脫劑量為3 BV。

2.5 純化工藝驗(yàn)證

結(jié)果見(jiàn)表3，可以得出，縱條紋炭角菌粗提物中Xylastriamide A純度為4.13%，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后，該環(huán)肽含量平均純度為39.63%，純化后該環(huán)肽純度有極大提高，說(shuō)明D101對(duì)縱條紋炭角菌中的環(huán)肽Xylastriamide A純化效果良好。

圖6 洗脫劑量對(duì)大孔樹(shù)脂解吸條件的影響

表3 Xylastriamide A在大孔樹(shù)脂中純化前后對(duì)比

3 結(jié)論與討論

通過(guò)比較4種大孔吸附樹(shù)脂（H101、HP20、D101、AB-8）對(duì)縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A的吸附-解析效果影響，同時(shí)對(duì)D101大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及靜態(tài)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，D101大孔樹(shù)脂對(duì)縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A具有較好的吸附-解吸作用，且綜合成本考慮，選用D101大孔吸附樹(shù)脂來(lái)分離純化縱條紋炭角菌中環(huán)肽。

D101大孔樹(shù)脂對(duì)縱條紋炭角菌中環(huán)肽動(dòng)態(tài)吸附-解吸的最佳工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度3 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣量7 BV；解吸時(shí)用40%乙醇3 BV洗去雜質(zhì)，用100%乙醇3 BV解吸，解吸流速2 BV/h。

D101大孔樹(shù)脂經(jīng)過(guò)多次的吸附-解吸試驗(yàn)，其依然具有良好的吸附效果，說(shuō)明D101大孔樹(shù)脂具有較好的重復(fù)利用性，且樹(shù)脂預(yù)處理簡(jiǎn)單，成本低廉，安全無(wú)害，適合工業(yè)生產(chǎn)或者大規(guī)模利用。采取該工藝分離縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A可以減少環(huán)肽損失，提高環(huán)肽純度，也為用D101樹(shù)脂來(lái)分離純化其他類型的環(huán)肽研究奠定基礎(chǔ)，提供一定參考價(jià)值。