FOXM1/FOXO3a在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及臨床意義

許君偉 梁亞林 宋 麗

肝癌通常是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的慢性感染引起[1]，病理學(xué)活檢為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其是有創(chuàng)性檢查，近年來(lái)影像學(xué)診斷逐漸被廣泛應(yīng)用，但其診斷特異性仍待提高[2-3]。研究顯示：乙肝發(fā)展到乙肝相關(guān)性肝癌涉及多基因與腫瘤標(biāo)志物在不同節(jié)點(diǎn)的表達(dá)[4]。甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、腫瘤抗原199(CA199)等腫瘤標(biāo)志物在一些惡性腫瘤的診斷、病情判斷以及療效監(jiān)測(cè)方面具有一定臨床價(jià)值[5]，但其特異性、敏感度仍不理想，因此更加可靠、準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)研究仍是該腫瘤診斷的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容[6]。FOXM1(forkhead transcription factor M1)基因在多種腫瘤中廣泛存在，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲等。FOXO3a(forkhead box O3a)作為FOXM1上游調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)OXM1/FOXO3a信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能來(lái)發(fā)揮調(diào)控癌癥發(fā)生與發(fā)展的作用[7-8]。本文具體探討了FOXM1/FOXO3a在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及臨床意義，希望為乙肝相關(guān)性肝癌的診斷和治療提供新的思路和方法?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

于2015年8月到2020年5月選擇的92例HBV相關(guān)性肝癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)疾病均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為HBV相關(guān)性肝癌，臨床及病理資料完整；無(wú)遠(yuǎn)處及淋巴轉(zhuǎn)移；患者在病理檢查前均未接受過(guò)化療、放療和其他抗腫瘤治療；術(shù)前無(wú)嚴(yán)重的合并疾病；年齡20～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并HCV感染的患者；伴有嚴(yán)重的其他疾病者；臨床與病理資料缺乏者。

本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)與所有入選患者的知情同意。入選的92例患者中，年齡最小32歲，最大75歲，平均年齡(58.22±2.18)歲，其中≥60歲50例，<60歲42例；臨床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期22例；組織學(xué)分化：高分化43例，中分化27例，低分化22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)45例，B級(jí)47例；糖尿病史32例、高血壓病史25例、吸煙史54例、飲酒史43例；病理特征：鱗癌32例，腺癌60例。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(78.24±11.59)IU/l，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) (67.21±12.04)IU/l，谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(GGT)(118.03±22.71)IU/l，乳酸脫氫酶(LDH)(220.19±32.71)IU/l，堿性磷酸酶(ALP)(132.19±34.19)U/l，AFP(872.71±128.29)μg/l，CEA(4.92±0.31)mg/l，CA199(58.22±14.29)U/ml。

1.2 FOXM1/FOXO3a表達(dá)檢測(cè)

SP免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司，F(xiàn)OXM1兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶500)、FOXO3a兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶200)購(gòu)于博奧森生物技術(shù)有限公司。二甲苯茂軍化工科技有限公司，PBS購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，中性樹(shù)膠購(gòu)自邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

取所有患者的病灶組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本，按照石蠟切片常規(guī)步驟進(jìn)行制片并切片，然后經(jīng)檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復(fù)預(yù)處理。取出抗原修復(fù)盒，待修復(fù)液自然冷卻，PBS洗滌3次，滴加3% H2O2，室溫靜置10 min；PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10～15 min。滴加抗MFGE8抗體2 μl，置于濕盒內(nèi)，4 ℃過(guò)夜。PBS洗滌3次，滴加復(fù)合二抗2 μl，室溫靜置20 min；PBS洗滌3次后DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

“互聯(lián)網(wǎng)+”大環(huán)境之下，云計(jì)算等新一代信息技術(shù)不斷促進(jìn)互聯(lián)網(wǎng)與各種傳統(tǒng)行業(yè)進(jìn)行深度融合，業(yè)務(wù)體系的全面更新、商業(yè)模式的重新構(gòu)建等顯著變化宣告著大數(shù)據(jù)時(shí)代的正式來(lái)臨。同其他傳統(tǒng)行業(yè)一樣，房地產(chǎn)估價(jià)行業(yè)也正面臨著資源的整合與轉(zhuǎn)型，如何應(yīng)對(duì)及利用大數(shù)據(jù)時(shí)代帶來(lái)的挑戰(zhàn)和機(jī)遇，進(jìn)而為房地產(chǎn)估價(jià)行業(yè)的發(fā)展帶來(lái)新的空間，是每一個(gè)房地產(chǎn)估價(jià)人都需引以深思的命題。

1.3 預(yù)后隨訪

以手術(shù)日期為起始時(shí)間，隨訪截至日期為2020 年8月1日，通過(guò)微信、門診、電話、入戶等隨訪方式，調(diào)查患者的預(yù)后生存與死亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

不同組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Child-Pugh分級(jí)患者的FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2 結(jié)果

2.1 FOXM1/FOXO3a表達(dá)水平對(duì)比

在92例HBV相關(guān)性肝癌患者中，病灶組織的FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率為72.8%和83.7%，都顯著高于癌旁組織的33.7%和23.9%(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同組織的FOXM1/FOXO3a表達(dá)水平對(duì)比(例，%)

2.2 肝癌臨床病理特征與FOXM1/FOXO3a的相關(guān)性

應(yīng)用SPSS 22.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)百分比以及均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)與計(jì)量數(shù)據(jù)，比較分別采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，Pearson進(jìn)行相關(guān)分析，COX進(jìn)行多因素回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α<0.05。

表2 不同臨床病理特征HBV相關(guān)性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表達(dá)水平對(duì)比(例，%)

叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)蛋白具有“翼狀螺旋結(jié)構(gòu)”DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，人類FOXM1基因定位12p13-3c，可刺激細(xì)胞由靜止期進(jìn)入到細(xì)胞周期，從而調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與增殖，從而與多種惡性腫瘤存在相關(guān)性[12]。FOXO3a定位于6q21，編碼673 個(gè)氨基酸，為胰島素/磷酸肌醇-3激酶的重要信號(hào)通路因子，其活性水平受到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、基因表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等多種因素的影響[13]。本研究顯示在92例HBV相關(guān)性肝癌患者中，病灶組織的FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率為72.8%和83.7%，都顯著高于癌旁組織的33.7%和23.9%(P<0.05)，表明FOXM1/FOXO3a信號(hào)通路在乙肝相關(guān)性肝癌中呈現(xiàn)激活表達(dá)狀態(tài)。

選用由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供的清潔級(jí)Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例為1：1，體重250～280 g。

提升社會(huì)力量的食品安全監(jiān)督力度。社會(huì)監(jiān)督組織應(yīng)該不斷強(qiáng)化自身的職責(zé)，在政府等相關(guān)部門的有效引導(dǎo)下，整合政府和食品企業(yè)發(fā)布的各項(xiàng)信息資源，利用媒體宣傳等手段表達(dá)自己的訴求。在日常的生活中一旦發(fā)現(xiàn)違法的食品企業(yè)或行為，應(yīng)立即舉報(bào)。除此之外，法律監(jiān)督部門也應(yīng)該強(qiáng)化自身職責(zé)，利用立法和檢舉等方法從根源上杜絕食品安全問(wèn)題的發(fā)生[2]。

表3 HBV相關(guān)性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性(n=92)

2.3 預(yù)后情況

所有患者隨訪到2020 年8月1日，平均隨訪時(shí)間(25.82±1.38)個(gè)月，92例患者中死亡42例，死亡率為45.6%。

2.4 影響因素分析

肝癌為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后差，惡性程度高等特點(diǎn)。HBV相關(guān)性肝癌是原發(fā)性肝癌中的一種最主要類型，沿海地區(qū)高發(fā)，可發(fā)生于任何年齡段[9]。該腫瘤早期起病隱匿，往往發(fā)病就診時(shí)患者已處于中晚期，且常伴有癌栓與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，使得其根治性手術(shù)切除的應(yīng)用受到極大的限制，因而死亡率較高[9]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究已表明癌基因激活與腫瘤抑制基因失活、等位基因的雜合性缺失、染色體不穩(wěn)定與失衡、表觀遺傳性基因沉默等與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，臨床上也已經(jīng)出現(xiàn)了針對(duì)特定分子的靶向藥物治療[10-11]。

表4 乙肝相關(guān)性肝癌患者預(yù)后死亡的多因素分析(n=92)

3 討論

在92例HBV相關(guān)性肝癌患者中，以預(yù)后死亡作為因變量，COX回歸分析顯示組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率為影響患者預(yù)后死亡的主要因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

Pearson相關(guān)分析顯示患者的組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Child-Pugh分級(jí)與FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率都存在相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表3。

陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)細(xì)胞染色程度和陽(yáng)性百分比進(jìn)行乘積評(píng)分，兩項(xiàng)得分乘積≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。

本研究顯示不同組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Child-Pugh分級(jí)患者的FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Pearson相關(guān)分析顯示患者的組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Child-Pugh分級(jí)與FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率都存在相關(guān)性(P<0.05)。從機(jī)制上分析，F(xiàn)OXM1是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等[14]。FOXM1過(guò)表達(dá)和E-cadherin表達(dá)下降與惡性腫瘤組織分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，RNA干擾介導(dǎo)的FOXM1敲低能夠顯著抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移[15]。FOXO3a是FOXM1轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)節(jié)基因，也是PI3K-AKT信號(hào)通路的重要下游效應(yīng)物，F(xiàn)OXM1/FOXO3a信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、血管生成來(lái)調(diào)節(jié)惡性腫瘤的起始，也可影響腫瘤的病理特征[16-17]。

本研究所有患者隨訪到2020 年8月1日，平均隨訪時(shí)間(25.82±1.38)個(gè)月，92例患者中死亡42例，死亡率為45.6%；COX回歸分析顯示組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FOXM1、FOXO3a表達(dá)陽(yáng)性率為影響患者預(yù)后死亡的主要因素(P<0.05)。不過(guò)本研究也有一定的不足，研究的樣本數(shù)量較少，影響患者預(yù)后的因素比較多，因此研究可能存在一定的偏倚性，將在下一步進(jìn)行深入分析。

管道平面設(shè)計(jì)原則：一要線路短、起伏小、土石方工程量小、造價(jià)經(jīng)濟(jì)；二要考慮拐點(diǎn)數(shù)量、角度、過(guò)路、過(guò)溝，同時(shí)考慮避讓村莊、房屋、田地、輸電線路桿塔、墳地，減少拆遷及附著物賠償費(fèi)用；三要盡量避免穿越河谷、山脊、沼澤和泄洪地區(qū)；四要考慮近遠(yuǎn)期結(jié)合和分期實(shí)施的可能。

用三維軟件建立實(shí)體三維模型，在有限元仿真分析軟件中對(duì)三維模型進(jìn)行網(wǎng)格劃分和材料屬性添加。實(shí)體三維模型如圖1所示。

總之，乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病與FOXM1/FOXO3a信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，且其相關(guān)蛋白的表達(dá)與患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，可作為患者預(yù)后死亡評(píng)估的重要影響指標(biāo)。