電離輻射對大鼠下頜下腺旁細胞途徑分泌的影響

吳言輝 許輝 姚清婷 劉少華 艾皮孜古麗·亞庫普 路利丹 石亮

1.新疆醫(yī)科大學，烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔頜面外科，烏魯木齊830001；3.山東大學齊魯醫(yī)院口腔頜面外科，濟南250012；4.山東大學口腔醫(yī)學研究所，濟南250012

放射損傷造成的口腔干燥癥是頭頸部鱗狀細胞癌放療后最常見的并發(fā)癥之一[1]。電離輻射損傷涎腺導(dǎo)致分泌功能降低可伴發(fā)猖獗齲、吞咽及語言功能障礙等，嚴重影響生活質(zhì)量。因此，對電離輻射涎腺損傷機制更好地了解可為防治唾液腺分泌功能異常提供新的思路。下頜下腺唾液分泌量占口腔靜息分泌總量的60%~65%，對維持口腔濕潤起重要作用。在生理狀態(tài)下毒蕈堿型乙酰膽堿受體（muscarinic acetylcholine receptor，M 受體）亞型M3 調(diào)控水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）介導(dǎo)的涎腺跨細胞分泌與claudin-4 介導(dǎo)的涎腺旁細胞分泌途徑是下頜下腺水和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運的兩種重要方式[2]。通常緊密連接（tightjunction，TJ）為維持唾液腺上皮的極性、建立正常的跨上皮細胞離子梯度提供了重要保障，是水、離子和小分子物質(zhì)經(jīng)過旁細胞途徑轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和限制因素。電離輻射損傷后AQP5介導(dǎo)的涎腺跨細胞分泌途徑損傷可能參與唾液腺分泌功能低下[3-4]。但是目前關(guān)于放射損傷對TJ 超微結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的旁細胞分泌途徑影響如何，以及在旁細胞途徑中對離子調(diào)控起主導(dǎo)作用的claudin-4 如何改變尚不清楚。本實驗旨在建立大鼠下頜下腺放射損傷模型，探討電離輻射對下頜下腺TJ 超微結(jié)構(gòu)及claudin-4 的影響，為進一步闡述電離輻射后唾液腺的損傷機制，防治唾液腺分泌功能異常提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

8 周齡健康雄性Wistar 大鼠24 只，體重250 g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（批準號：IACUC20190704-01）。

醫(yī)用直線加速器（Elekta公司，瑞典），ECLIPSE Ci-L951175 光學顯微鏡（Nikon 公司，日本），JEM-1230 透射電子顯微鏡（JEOL 公司，日本），IX71-12FL/PH 型熒光顯微鏡（OLYMPUS 公司，日本），M3 受體抗體（bs-1289R，1∶50）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；AQP5抗體（178615，1∶50）購于美國Sigma公司；claudin-4抗體（BS-1068，1∶50）購于美國Bioworlde公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠下頜下腺放射損傷模型的建立 將Wi‐star大鼠隨機分為對照組和照射組，照射組又分為照射后1、4、12 周組，每組6 只。研究證實15 Gy以上劑量照射可以造成涎腺組織不可逆性損傷，本實驗參照文獻[5]報道一次性給予下頜下腺20 Gy照射。具體操作如下。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，醫(yī)用直線加速器一次性給予右側(cè)下頜下腺區(qū)20 Gy 照射[6]（射線類型：電子線；能量：6 MeV；劑量率：4 Gy·min-1；中心皮距：100 cm）。照射前標記照射區(qū)域（暴露區(qū)域：2.5 cm×2.0 cm），照射范圍包括全部的右側(cè)下頜下腺。其他部位由3 mm鉛板遮擋，避免射線影響。

1.2.2 腺體分泌量檢測 照射后1、4、12周，各組大鼠再次麻醉，于口底前部將直徑0.5 mm 的聚乙烯塑膠管插入右側(cè)下頜下腺導(dǎo)管內(nèi)，右側(cè)頰部制備隧道將聚乙烯塑膠管引出口外固定。待大鼠恢復(fù)意識2 h后，在插管當日上午9~12時測量腺體的分泌量，采用Schirmer 實驗，以5 min 內(nèi)濾紙條（35 mm×5 mm）濕潤的長度來表示分泌多少。測量結(jié)果重復(fù)2次，間隔10 min，取平均值[4]。

1.2.3 腺體組織的病理學觀察 游離摘除右側(cè)腺體，取部分組織10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片，厚5 μm，蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，封固。每組在400倍光學顯微鏡下隨機選取10 個鏡下視野，觀察腺體病理學變化，用圖像測量軟件Image J 1.46r計數(shù)腺泡細胞數(shù)目，取均值[4]。

1.2.4 透射電鏡觀察腺體TJ 超微結(jié)構(gòu) 取1 mm3組織，2.5%戊二醛固定、沖洗、1%鋨酸固定，脫水、包埋、切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，50 000 倍透射電鏡下觀察TJ 超微結(jié)構(gòu)變化，每組隨機選取10個鏡下視野測量寬度，取均值[7]。

1.2.5 免疫熒光檢測M3、AQP5、claudin-4 的分布取部分組織10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片，微波修復(fù)15 min，室溫30 min，M3、AQP5、claudin-4（1∶50） 4 ℃孵育過夜。Cy3-IgG （1∶100）37 ℃孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole， DAPI） 孵 育 5 min，核染，封片，熒光顯微鏡下觀察分布變化，M3、AQP5 每例隨機選取10 個不同腺泡細胞，每組6例，定量計算熒光強度，取均值（claudin-4 選取導(dǎo)管細胞）[8]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測M3、AQP5、claudin-4的表達 取冰凍組織，裂解離心，BCA法測蛋白濃度。40 μg總蛋白12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate poly‐acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene difuoride，PVDF）200 mA下M3 120 min，AQP5、claudin-4 70 min，β-actin 90 min。5%脫脂奶粉TBST（Tris-base，NaCl，冰醋酸，吐溫20） 室溫2 h，M3、AQP5（1∶1 000），claudin-4（1∶800），β-actin（1∶500）4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）二抗（1∶50 000）孵育2 h?；瘜W發(fā)光劑發(fā)光并觀察檢測結(jié)果，采用BandScan分析膠片的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采 用 GraphPad Prism 8.0 及 IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用K-S檢驗證實數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，Levene 檢驗數(shù)據(jù)方差齊，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩多重比較采用LSD 法，各照射組與對照組進行比較后，照射組組間再進行兩兩比較。檢驗水準為雙側(cè)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分泌量變化

Schirmer 實驗結(jié)果顯示，對照組及照射后1、4、12 周唾液分泌量分別為 （2.09±0.05）、（1.51±0.05）、（1.46±0.04）、（1.19±0.05）mm，照射側(cè)腺體分泌量在1、4、12 周較對照組明顯降低（P<0.01）；4周較1周降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；12周較1、4周時分泌量明顯降低（P<0.01）。

2.2 病理學變化

對照組腺體組織光鏡下可觀察到清晰的腺泡和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)；照射后1周可見腺體間質(zhì)淤血水腫，局灶腺上皮細胞胞漿空泡變，少數(shù)細胞核核固縮、深染，查見少量炎細胞浸潤；照射后4周仍可見間質(zhì)水腫、空泡變、核固縮、核深染，查見小灶腺體壞死伴少量中性粒細胞浸潤；照射后12 周間質(zhì)淤血水腫減輕，仍可見細胞胞漿空泡變，部分腺上皮細胞核核固縮、深染，查見多處小灶性腺體壞死伴中性粒細胞浸潤（圖1）。經(jīng)腺泡細胞計數(shù)，對照組腺泡細胞為每視野（517.90±16.44）個，電離輻射后1、4、12 周照射組腺泡細胞數(shù)分別為（510.60±14.08）、（452.20±12.06）、（357.10±11.48） 個。經(jīng)統(tǒng)計學分析，照射后1周腺泡細胞數(shù)與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），4、12周明顯小于對照組（P<0.01），12周較4周明顯減少（P<0.01）。

圖 1 下頜下腺電離輻射后的組織形態(tài)學變化 HE × 400Fig 1 The histomorphological changes of the submandibular glands after irradiation HE × 400

2.3 TJ超微結(jié)構(gòu)變化

對照組腺體相鄰腺泡上皮細胞間靠近腺泡腔的位置可觀察到基本完整、清晰的細胞間TJ 結(jié)構(gòu)（圖2）。與對照組相比：1 周TJ 結(jié)構(gòu)模糊、崩塌；4 周電子密度降低；12 周模糊、崩塌明顯（圖2）。對照組的TJ 寬度為（17.46±0.07）nm，電離輻射1、 4、 12 周 照 射 組 的 TJ 寬 度 分 別 為 （12.67±0.11）、（12.60±0.09）、（9.67±0.10）nm。經(jīng)統(tǒng)計學分析，照射后1、4、12 周的TJ 寬度明顯小于對照組（P<0.01），照射后4周與1周的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），照射后12 周顯著少于1、4 周（P<0.01）。

圖 2 電離輻射對下頜下腺TJ超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡 × 50 000Fig 2 Effects of radiation on TJ ultrastructure in submandibular glands transmission electron microscopy × 50 000

2.4 M3、AQP5及claudin-4分布變化

各組M3、AQP5 及claudin-4 的分布變化見圖3、4。對照組M3 彌散分布在腺泡細胞的胞漿和胞膜上，AQP5 主要分布在腺泡細胞和導(dǎo)管細胞的頂、側(cè)膜上；照射后各時間點M3、AQP5 的熒光分布無明顯改變。但其熒光強度逐漸減弱（P<0.01），照射后4、12周較1周明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），12 周與4 周相比熒光強度減弱（P<0.05）。對照組claudin-4 主要分布在導(dǎo)管細胞的側(cè)膜和基底膜上。照射后各時間點claudin-4的熒光分布特性沒有明顯改變。但其熒光強度持續(xù)增強（P<0.01），照射后4 周較1 周增加（P<0.05），12 周與1、4 周相比熒光強度明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.5 M3、AQP5及claudin-4表達變化

Western blot 檢測結(jié)果見圖5。由圖5 可見，與對照組相比，照射后1、4、12 周M3、AQP5 蛋白表達持續(xù)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），12周時蛋白表達量較1、4 周降低，差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）；而claudin-4 在照射后1、4、12 周蛋白水平顯著高于對照組，呈時間依賴性高表達（P<0.01），12 周時蛋白表達量較1、4 周增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

照射和炎癥可能導(dǎo)致腺泡細胞凋亡和/或功能障礙，造成組織損傷，唾液分泌能力降低，這可能是頭頸部癌癥放療患者以及自身免疫性疾病如干燥綜合征患者唾液腺分泌功能低下的主要原因[9-10]，其具體機制尚不清楚。TJ 廣泛存在于所有上皮或內(nèi)皮細胞間連接的最頂端，是物質(zhì)經(jīng)旁細胞途徑轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。TJ 在涎腺上皮構(gòu)成一個動態(tài)、可被調(diào)控的旁細胞屏障，其表達與分布的改變會引起通透性的變化，從而影響旁細胞途徑的水分泌。許多內(nèi)源或外源性刺激可通過激活某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于TJ，影響其結(jié)構(gòu)和功能，旁細胞途徑生理性屏障功能受損，通透性發(fā)生改變，誘發(fā)病理性損害。研究[8]證實激活M3受體介導(dǎo)TJ 的開放程度，可以調(diào)控唾液分泌。本實驗通過建立下頜下腺放射損傷模型，觀察腺體分泌功能、組織學變化、TJ超微結(jié)構(gòu)變化、M3受體、AQP5 及TJ 蛋白claudin-4 的表達分布改變。顯示電離輻射后早期TJ 寬度的減少，M3 受體與AQP5 蛋白下調(diào)，claudin-4 表達增多可能是下頜下腺放射損傷后唾液分泌功能減退的重要原因。

圖 3 下頜下腺電離輻射后M3、AQP5、claudin-4的分布改變 免疫熒光染色 × 400Fig 3 The changes of M3,AQP5 and claudin-4 on the distributions in submandibular glands after irradiation immunofluorescence × 400

圖 4 照射1、4、12周后，M3、AQP5和claudin-4的熒光強度變化Fig 4 The changes in the fluorescence intensity of M3,AQP5 and claudin-4 at 1,4 and 12 weeks after irradiation

嚙齒類動物唾液腺經(jīng)15 Gy以上電離輻射后在早期表現(xiàn)為分泌功能快速降低，在中后期腺泡細胞數(shù)目逐漸減少，在3月后進入比較穩(wěn)定的緩慢恢復(fù)期。3 月內(nèi)對輻射損傷的下頜下腺、腮腺等局部或全身用藥干預(yù)均可顯著改善腺體分泌功能[9]。在本實驗中，電離輻射損傷后早期表現(xiàn)為組織水腫，而12 周進入損傷后期表現(xiàn)為核固縮、炎性細胞浸潤、病理性小灶壞死、腺泡細胞數(shù)量明顯降低[11]。通過下頜下腺插管，收集靜息狀態(tài)下單純下頜下腺唾液分泌量，計量顯示1、4 周唾液分泌量分別為（1.51±0.05）、（1.46±0.04）mm，較正常組顯著降低了28%、30%，12周時分泌降低達到43%，功能損傷進一步加重，與組織學變化相一致。

圖 5 下頜下腺電離輻射后M3、AQP5、claudin-4的表達Fig 5 The expressions of M3,AQP5 and claudin-4 in submandibular glands after irradiation

唾液中水分約占99%，在正常腺體中主要由M3 受體參與調(diào)控完成。唾液腺水分泌有2 條主要的途徑，即經(jīng)水通道蛋白直接穿過基底膜和頂膜的跨細胞途徑和經(jīng)細胞間TJ調(diào)控的旁細胞途徑[12]。下頜下腺中M 受體是介導(dǎo)跨細胞及旁細胞途徑水分泌調(diào)控的重要信使，激活后可引起大鼠腮腺中AQP5 從細胞漿向頂膜的轉(zhuǎn)位，同時增加唾液的分泌。在放射性損傷的唾液腺以及舍格倫綜合征患者活檢的唇腺標本中均可檢測到AQP5的表達量降低和在腺泡頂側(cè)膜的分布降低，提示AQP5的分布和含量是決定水的跨細胞轉(zhuǎn)運的重要因素[3,13]。M3受體與AQP5 在對照腺體中含量更豐富，20 Gy 照射后隨著時間的推移在7 d 觀察到兩者蛋白表達明顯下降，第12 周時仍處于低水平。用免疫熒光顯微鏡觀察，則表現(xiàn)為熒光強度減弱，AQP5 在頂膜和側(cè)膜分布明顯減少。因此，兩者蛋白的表達減少以及組織結(jié)構(gòu)損傷可能是照射后唾液流量減少的原因之一。此外，近年來的研究[14]提示促分泌藥物如卡巴膽堿、腎上腺素等可以促進TJ 的通透性，增加水經(jīng)旁細胞途徑的轉(zhuǎn)運，進而發(fā)揮促分泌的作用。如放射損傷前后給予M 受體激動劑匹魯卡品可以一定程度抑制電離輻射損傷腺體的分泌低下，改善分泌功能[15]。這提示放療可能會直接損傷TJ 結(jié)構(gòu)，引起旁細胞分泌功能的降低。為此該實驗通過透射電鏡對放射后下頜下腺超微結(jié)構(gòu)進一步觀察，發(fā)現(xiàn)在對照組相鄰腺泡上皮細胞間靠近腺泡腔的位置可觀察到完整、清晰的細胞間TJ 結(jié)構(gòu)，它是介導(dǎo)水和電解質(zhì)經(jīng)旁細胞途徑轉(zhuǎn)運的大分子蛋白復(fù)合物，主要行使“屏障”和“柵欄”功能[12,16]。電離輻射后1 周，TJ 結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為模糊、崩塌；4 周可見電子密度降低；12 周TJ結(jié)構(gòu)破壞最明顯，TJ 寬度較1、4 周均明顯降低（P<0.01）。TJ 寬度是一項可以反映其“屏障”功能的重要指標，是指相鄰細胞的TJ之間的距離[17]。該結(jié)果說明電離輻射造成TJ 結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致開放程度改變引起旁細胞途徑水轉(zhuǎn)運能力改變。TJ 蛋白復(fù)合物主要由跨膜蛋白和胞漿蛋白構(gòu)成，跨膜蛋白通過胞外環(huán)相互作用封閉細胞旁間隙，clau‐dins作為跨膜蛋白的主要封閉蛋白，在維持上皮細胞“屏障”、保持TJ 完整性上發(fā)揮重要作用[18]。claudin-4 作為claudins 家族成員之一，主要分布、表達于大鼠下頜下腺細胞膜上，經(jīng)激活M3受體調(diào)控claudin-4 的表達可增加旁細胞途徑的通透性[2]。在嚙齒動物唾液腺中claudin-4 僅在導(dǎo)管細胞中表達[19]，其表達量的變化會影響TJ 的屏障特性，當其表達增加會引起下頜下腺腺泡細胞的跨上皮電阻升高，降低細胞的通透性[20]。在本研究中，輻照后TJ 蛋白分子claudin-4 表達水平呈時間依賴性增加，引起了不可逆的分泌功能障礙。通常正常大鼠claudin-4 的表達水平很低，claudin-4 特異性定位于導(dǎo)管，腺泡幾乎無表達，而導(dǎo)管組織占腺體體積的10%以下，其整個腺體表達水平在免疫印跡分析中顯得微弱。該研究中claudin-4 在照射后1 周和4 周被清楚地檢測到明顯增加，12周時仍處于高表達水平。在電離輻射后claudin-4 無論是蛋白表達量還是在腺泡以及導(dǎo)管上皮分布的熒光強度，均表現(xiàn)為上升趨勢，提示claudin-4 發(fā)生了重分布，會引起下頜下腺腺泡細胞的跨上皮電阻增加，降低細胞的通透性。電離輻射后TJ 結(jié)構(gòu)損傷，可能是輻射損傷唾液分泌降低的重要機制，有待進一步研究。

綜上所述，大鼠下頜下腺經(jīng)電離輻射后腺泡細胞數(shù)目減少，AQP5跨膜轉(zhuǎn)運通路受損，TJ寬度發(fā)生變化，而claudin-4表達增高，這提示M3受體介導(dǎo)的旁細胞水分泌途徑改變也參與了電離輻射對下頜下腺分泌減少。這些發(fā)現(xiàn)豐富了對唾液腺放射損傷機制的認識，并可能為放療損傷后下頜下腺分泌功能減退的治療策略提供新的見解。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。