基于NLRP3炎性小體探討芍藥甘草湯對神經(jīng)根型頸椎病大鼠的抗炎鎮(zhèn)痛機制

楊芳潔，吳大偉，何 堅*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；2.江蘇省鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城224000）

頸椎病是一種與年齡有關(guān)的常見頸椎退行性疾?。?］，我國頸椎病的患病率為17.3%，其中神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylotic radiculopathy，CSR）占60%～70%［2］。該病的主要臨床表現(xiàn)為神經(jīng)根性痛，炎癥介質(zhì)是誘發(fā)CSR疼痛的關(guān)鍵因素［3］。最新研究報道，NLRP3炎性小體的合成與釋放在神經(jīng)根性疼痛中具有重要作用［4］。芍藥甘草湯可柔肝益脾、通順血脈、緩急止痛，是治療痙攣疼痛的良方。本團隊前期研究證明芍藥甘草湯對于治療頸椎病有效［5-6］，但芍藥甘草湯治療急性期CSR的作用機制尚未明確。本研究采用“椎管插線法”建立急性期CSR大鼠模型［7］，探討芍藥甘草湯對CSR模型大鼠的可能作用機制，為芍藥甘草湯臨床療效的科學(xué)內(nèi)涵以及進一步推廣提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只健康成年的SPF級SD大鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量200～250g，于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（閩）2012-001。

1.2 實驗藥物 芍藥甘草湯藥物組成：白芍12g，甘草12g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院中藥房的顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司）。

1.3 實驗試劑 蘇木素伊紅染液（北京索萊寶公司）；rat IL-18 Elisa Kit（上海西唐生物公司）；Anti-NLRP3 antibody（英國艾博抗公司）。

1.4 實驗儀器 YB-6LF生物組織石蠟包埋機（湖北陽光科技有限公司）；RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；BH-2德國光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Tecan M200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；Leica DM4000B熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDocXRS+System超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BioSpec 70／20USR小動物核磁成像系統(tǒng)（美國BRUKER公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組 將大鼠分為假手術(shù)組（n＝12）和造模組（n＝48），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后參照文獻［7］對造模組大鼠進行造模，術(shù)后予注射慶大霉素防止局部感染。造模第2天采用影像學(xué)測評結(jié)合BBB評分［8］驗證造模是否成功之后進行藥物干預(yù)。

2.2 干預(yù)方法 將造模組隨機分為模型組、芍藥甘草湯低劑量組（低劑量組）、芍藥甘草湯中劑量組（中劑量組）和芍藥甘草湯高劑量組（高劑量組）各12只。低、中、高劑量組大鼠分別按1.08、2.16、4.23 g／（kg·d）予芍藥甘草湯藥液進行灌胃，假手術(shù)組及模型組以同等劑量予生理鹽水灌胃，早、晚各灌1次，連續(xù)干預(yù)1周。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 機械痛閾測定 分別于藥物干預(yù)后的第1天、第3天及第7天，采用up-and-down法通過Von Frey纖維絲測定各組大鼠后腳趾對機械刺激50%縮爪閾值的變化。

2.3.2 IL-18檢測 于末次閾值測定后，在深度麻醉下經(jīng)腹主動脈采全血，采用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清IL-18含量，用酶標儀在450 nm波長下測量光密度（OD值）。

2.3.3 脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù) 每組隨機選取6只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉并取血后取出脊髓組織。采用蘇木素染色以及伊紅染色法將大鼠頸脊髓組織染色后，使用光學(xué)顯微鏡高倍光鏡下觀察各組大鼠頸部脊髓組織中脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量的變化情況。

2.3.4 檢測脊髓組織中NLRP3蛋白表達水平 采用蛋白印跡法檢測頸部脊髓組織中NLRP3蛋白的表達水平，用超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影與分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 5組大鼠機械痛閾值比較 見表1。

表1 5組大鼠機械痛閾值比較（±s）s

表1 5組大鼠機械痛閾值比較（±s）s

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組相比，2）P＜0.01；與低劑量組相比，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 1212121212術(shù)后1 d 13.41±1.3111.16±1.021）11.33±1.541）11.25±0.971）11.08±1.241）術(shù)后3 d 13.25±1.849.91±0.991）10.41±0.901）10.00±1.201）10.08±0.791）術(shù)后7 d 12.91±1.316.91±1.311）6.83±1.191）10.33±1.151）2）3）10.08±0.991）2）3）

3.2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù) 見圖1、表2。

圖1 5組大鼠頸部脊髓前角HE染色圖（×400）

表2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)（±s） 個／高倍視野

表2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)（±s） 個／高倍視野

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 66666數(shù)目62.2±6.735.9±4.21）47.9±4.22）54.9±4.42）3）58.2±5.72）3）

3.3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較 見圖2、表3。

圖2 5組大鼠脊髓NLRP3蛋白電泳圖

表3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較（±s）

表3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與低劑量組比較，4）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n66666 NLRP351.57±3.3791.71±5.261）83.42±4.922）59.34±7.363）4）51.64±5.153）4）

3.4 5組大鼠IL-18表達水平比較 見表4。

表4 5組大鼠IL-18表達水平比較（±s）pg／mL

表4 5組大鼠IL-18表達水平比較（±s）pg／mL

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 1212121212 IL-1840.11±3.9480.79±2.231）75.37±2.0053.93±5.622）3）50.54±4.082）3）

4 討論

大量證據(jù)表明，在急性CSR的脊髓損傷中，炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵作用［3，9］。NLRP3作為炎癥反應(yīng)的核心，是最典型的炎性小體，其在介導(dǎo)CSR的炎癥中至關(guān)重要。感覺神經(jīng)損傷后，位于脊髓背角的NLRP3炎性小體被激活，誘導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶-1，進而促進IL-18的合成，并通過多個下游信號通路促使神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷［10］。而神經(jīng)元存活是脊髓損傷后功能恢復(fù)的基礎(chǔ)［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組NLRP3炎性小體信號通路蛋白及IL-18表達升高，各劑量組NLRP3蛋白及IL-18表達均降低；模型組大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，各劑量組運動神經(jīng)元數(shù)量增加明顯。由此可見，抑制小膠質(zhì)細胞活化，阻斷持續(xù)性炎癥，促使神經(jīng)元存活是治療急性CSR的關(guān)鍵。

不僅如此，NLRP3炎性小體活化增強，釋放炎癥因子IL-18時，還會加速痛覺傳導(dǎo)，導(dǎo)致自發(fā)性疼痛、痛覺過敏（對傷害性刺激的痛覺增加）和機械性超敏（對正常無害刺激的痛覺過敏）［12］。本實驗機械痛閾結(jié)果表明，模型組大鼠的3次痛閾值持續(xù)降低，中、高劑量組的痛閾值顯著增高。由此可見，在神經(jīng)性疼痛中，當神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時，其敏感性的變化會持續(xù)存在，產(chǎn)生疼痛，痛閾值會急劇下降，導(dǎo)致無害的刺激也會產(chǎn)生疼痛，并且對有害刺激的反應(yīng)持續(xù)時間和強度也會增加［13］。因此，芍藥甘草湯可通過抑制NLRP3炎性小體，進而抑制機體炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)根型頸椎病大鼠神經(jīng)根組織，產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛的功效。

綜上所述，芍藥甘草湯對CSR大鼠模型有明顯鎮(zhèn)痛作用，能夠緩解局部的炎癥損傷，抑制脊髓局部NLRP3炎性小體活化，進而抑制促炎性細胞因子IL-18的表達，這可能是芍藥甘草湯治療大鼠急性期CSR的作用機制之一。本實驗僅對頸部脊髓前角相關(guān)神經(jīng)組織進行研究，而在背根神經(jīng)結(jié)等處是否具有相同的作用機制目前尚不清楚，還有待進一步深入研究。