益腎降濁沖劑對慢性腎衰竭大鼠腎臟Fas、FasL表達(dá)的影響

詹倩倩，鄭敏麟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

“培土制水法”復(fù)方益腎降濁沖劑，作為治療慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）的院內(nèi)制劑在福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院使用已有近20年的歷史，其可有效降低CRF患者血清血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平，改善臨床癥狀，延緩腎衰竭的進(jìn)展，療效確切［1-3］。研究表明，益腎降濁沖劑能減輕CRF腎小管間質(zhì)的損傷，其機制與糾正脂質(zhì)代謝紊亂、減輕腎內(nèi)脂質(zhì)蓄積、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)［4］。本課題組前期研究顯示，益腎降濁沖劑治療CRF作用機制可能通過提高線粒體呼吸功能和減少自由基ROS的產(chǎn)生，來抑制ROS介導(dǎo)的依賴經(jīng)典Caspase的線粒體凋亡通路，并通過調(diào)節(jié)腎組織細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2基因（Bcl-2）和促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)來減緩腎細(xì)胞凋亡，從而保護腎臟［5-7］。本研究在此基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用益腎降濁沖劑干預(yù)5／6腎大部分切除模型大鼠，進(jìn)一步觀察其減少CRF大鼠細(xì)胞凋亡，延緩疾病進(jìn)展的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級4周齡SD大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200g，購自上海史萊克實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號：20170005005915。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于自然光條件，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%，自由攝食飲水。

1.2 實驗藥物 益腎降濁沖劑組成：白術(shù)15g，茯苓15g，玉竹15g，當(dāng)歸15g，生黃芪30g，太子參15g，桑葚15g，六月雪15g，車前子15g，桑寄生15g，懷牛膝15g，丹參15g，山楂15g，陳皮15g，大黃15g，由福建省第三人民醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)方法煎煮藥液2次（大火煮開后，再用小火煮30 min），水煎并濃縮至每10mL藥液中含生藥9、18、36g，分別配成低、中、高劑量的水煎劑。大黃素由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.3 實驗試劑 Fas、FasL抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；DAB染色試劑盒、免疫組化二抗試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；BUN、Scr檢測試劑盒（長春匯力有限公司）。

1.4 實驗儀器 石蠟切片機（德國Leica公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；生物組織攤烤片機（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 72只SD大鼠，雌雄分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取60只作為手術(shù)組。手術(shù)組大鼠采用20%烏拉坦麻醉，以腹臥位對大鼠左背部手術(shù)區(qū)進(jìn)行去毛，沿左沿肋脊角做約2.0cm斜切口，鈍性分離肌肉層，充分暴露左腎，迅速切除左腎皮質(zhì)的2／3，紗布按壓止血，復(fù)位縫合，1周后切除右腎。手術(shù)完成后，按體質(zhì)量分層隨機分為模型組、大黃素組、益腎降濁沖劑高劑量組（簡稱高劑量組）、益腎降濁沖劑中劑量組（簡稱中劑量組）、益腎降濁沖劑低劑量組（簡稱低劑量組），每組各10只（除去術(shù)中、術(shù)后死亡的10只大鼠），雌雄分籠飼養(yǎng)。將剩下的12只大鼠隨機抽取10只作為假手術(shù)組。假手術(shù)組以同樣手術(shù)操作進(jìn)行，但不切腎臟。

2.2 干預(yù) 手術(shù)4周后開始灌胃，大黃素組大鼠按500mg／（kg·d）予大黃素水溶液灌胃，高、中、低劑量組大鼠分別按36、18、9 g／（kg·d）予益腎降濁沖劑藥液灌胃，模型組與假手術(shù)組給予同等體積蒸餾水灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)給藥8周。于干預(yù)8周后取材，采血備做腎功能檢查，并取腎皮質(zhì)組織放入甲醛水溶液中固定，備做石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 血清BUN、Scr含量檢測 經(jīng)腹主動脈采血，4500 r／min離心15 min，取上清液，按照BUN、Scr試劑盒說明書配制工作液，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度。

2.3.2 腎臟組織Fas、FasL免疫組織化學(xué)染色 取石蠟包埋好的腎皮質(zhì)組織，切片，二甲苯脫蠟40 min，100%、95%、80%、70%梯度酒精依次脫水，放于檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)20 min，冷卻至室溫后，PBS清洗，滴加過氧化氫室溫孵育10 min，PBS清洗，滴加山羊血清37℃下孵育60 min，滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗，孵育30 min后，PBS清洗，隨后DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水沖洗，蘇木素染核30 s，鹽酸酒精分化1 s，流水返藍(lán)15 min，中性樹脂封片。每組切片選取3個視野，采用Image-Pro Plus 6.0分析Fas、FasL的表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 6組大鼠血清Scr、BUN含量比較 見表1。

表1 6組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

表1 6組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與大黃素組比較，4）P＜0.05。

BUN／（μmol／L）23.20±3.9647.21±5.831）41.44±6.432）41.13±3.452）39.38±7.073）36.21±2.963）4）組別假手術(shù)組模型組大黃素組低劑量組中劑量組高劑量組n 101010101010 Scr／（mg／dL）71.89±13.61141.96±41.051）119.73±17.302）120.70±22.512）99.32±12.293）88.13±14.013）4）

3.2 6組大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)as、FasL蛋白主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，位于胞漿，呈淡黃色或棕色的陽性表達(dá)。結(jié)果見圖1～2、表2。

圖1 6組大鼠腎組織Fas蛋白免疫組化圖（×200）

4 討論

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對于CRF中醫(yī)病因病機的認(rèn)識趨于統(tǒng)一，多認(rèn)為CRF屬本虛標(biāo)實之證，本虛者乃脾腎虧虛，標(biāo)實則為濕濁、瘀血、痰濁及毒邪為主［8］。阮詩瑋教授根據(jù)長期臨床治療CRF總結(jié)的經(jīng)驗，認(rèn)為CRF患者多有食少納呆、倦怠乏力等脾虛癥狀，補腎藥多滋膩，使食欲減退（傷脾），造成藥物和營養(yǎng)吸收率更低，進(jìn)一步加重病情。

圖2 6組大鼠腎組織FasL蛋白免疫組化圖（×200）

表2 6組大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 6組大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與大黃素組比較，3）P＜0.05。

FasL 2094.54±412.6521977.77±2286.171）5068.99±1470.952）14767.67±3047.142）9482.23±913.912）4856.92±543.732）3）組別假手術(shù)組模型組大黃素組低劑量組中劑量組高劑量組n 333333 Fas 3170.63±358.1318563.27±2112.991）6128.17±668.162）13396.00±1403.462）8031.80±708.762）5074.53±299.872）3）

阮教授根據(jù)中醫(yī)“脾制水”和“后天養(yǎng)先天”的理論，創(chuàng)立了“培土制水法”益腎降濁沖劑。方中重用生黃芪、太子參、白術(shù)、茯苓健脾益氣為君；以玉竹、當(dāng)歸、桑葚益脾陰，以陳皮、山楂、丹參理脾運，以大黃、六月雪、車前子泄脾濁，共為臣藥；同時，精選桑葚、桑寄生、懷牛膝、當(dāng)歸四味藥補腎而不滋膩之藥，量小為佐使［6］；全方共奏健脾益腎、培土制水、祛瘀泄?jié)嶂?。循證醫(yī)學(xué)研究表明，大黃治療慢性腎功能衰竭可減少血Scr、BUN，糾正貧血和營養(yǎng)不良，緩解臨床癥狀［9］；大黃及大黃有效成分大黃素、大黃酸均能在腎臟細(xì)胞凋亡中起到一定的作用［10-11］。因此，本實驗將大黃素組作為對照組。

BUN和Scr是臨床病理學(xué)中檢測腎功能最常用的指標(biāo)，能夠在一定程度上反應(yīng)腎小球的濾過功能。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清Scr、BUN水平顯著增加，提示模型組大鼠慢性腎衰竭造模成功。與模型組相比，高、中、低劑量組大鼠血清Scr、BUN水平明顯下降，提示益腎降濁沖劑干預(yù)能明顯改善CRF大鼠腎功能，提高腎小球濾過率，延緩腎衰進(jìn)展，其中高劑量組治療效果優(yōu)于大黃素組。

Fas（Apo-1／CD95）是一種Ⅰ型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）／神經(jīng)生長因子受體家族；Fas L是一種Ⅱ型膜蛋白，它也是腫瘤壞死因子TNF家族的一員［12］。TNF受體家族的死亡受體，包括腫瘤壞死因子受體、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體和Fas介導(dǎo)的相關(guān)凋亡通路。在死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑中，膜配體（Fas L）與細(xì)胞死亡受體（Fas）結(jié)合，通過死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物傳遞凋亡信號，誘導(dǎo)Caspase的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13-15］。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組腎組織中Fas、Fas L蛋白表達(dá)水平顯著增加，高、中、低劑量組和大黃素組大鼠腎組織Fas、Fas L蛋白表達(dá)明顯下降，提示益腎降濁沖劑可通過下調(diào)腎組織Fas、Fas L的表達(dá)來減少CRF大鼠腎細(xì)胞凋亡，慢性腎衰進(jìn)展得到減緩，其中高劑量組治療效果優(yōu)于大黃素組。

綜上所述，益腎降濁沖劑能降低大鼠血清Scr、BUN水平，改善腎功能，其作用機制可能是通過Fas介導(dǎo)的C aspase凋亡途徑，減少腎組織Fas、Fas L的表達(dá)，來減緩腎細(xì)胞凋亡，從而延緩慢腎衰進(jìn)程。