UPLC-MS／MS法同時(shí)測(cè)定鼠曲草中的5個(gè)黃酮類化合物

蘇藝萍，李 煌*，褚克丹，吳文晞，葉向麗

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；2.福建恒正檢測(cè)技術(shù)有限公司，福建 福州350100；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州350001）

鼠曲草為菊科植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥全草，味甘微酸，有化痰止咳、祛風(fēng)除濕的功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，鼠曲草中含有黃酮類、氨基酸和揮發(fā)油等成分［2］，其中黃酮類含量豐富，是主要的活性成分，目前已經(jīng)從鼠曲草中分離得到的黃酮類化合物超過(guò)30種［3］。現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，黃酮類化合物具有多種藥理作用，如蘆丁、芹菜素和山奈酚具有抗炎、抗氧化等生物活性，木犀草素和金絲桃苷還有抗腫瘤作用［4-7］。目前，已有應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定鼠曲草黃酮類成分含量的相關(guān)研究報(bào)道［8-10］，但有些成分含量較低，成分間較難分離，因此對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定需要優(yōu)化方法，提高靈敏度。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）對(duì)分離度要求較低，且靈敏度高，能快速完成含量測(cè)定，如今也逐步應(yīng)用于中藥成分分析當(dāng)中［11-12］。因此，本研究建立了同時(shí)測(cè)定鼠曲草中的5個(gè)黃酮類成分（蘆丁、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚）含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS／MS），能滿足中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)要求，可為監(jiān)測(cè)鼠曲草的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Nexera X2超高效液相色譜儀（日本島津公司）；SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜（美國(guó)SCI EX公司）；XS105DU型十萬(wàn)分之一分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FY135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；TDL-40B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 6批鼠曲草分別產(chǎn)自安徽亳州、廣西桂林、云南曲靖、福建寧德、浙江溫州和四川瀘州，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為菊科植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥莖葉，樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究室，鼠曲草藥材粉碎備用。對(duì)照品木犀草素（美國(guó)MACK公司）；金絲桃苷、山奈酚（成都曼斯特生物科技有限公司）；蘆丁、芹菜素（上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取鼠曲草藥材粉末2 g于250mL的具塞錐形瓶中，加入60%乙醇80mL，密封稱定質(zhì)量，超聲提?。?00W，40 kHz）30 min，冷卻后以60%乙醇補(bǔ)足減失重量后過(guò)濾，濾渣再加入60%乙醇40mL，重復(fù)上述操作提取，合并2次濾液，5000 r／min下離心10 min，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得供試品溶液。供試品稀釋液（100倍）：吸取100μL供試品溶液至10mL量瓶，用超純水定容，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 取蘆丁、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚的對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.330、1.040、1.540、1.240、1.000mg／mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別量取上述各化合物對(duì)照品儲(chǔ)備液75.2、96.2、65.0、80.6、100.0μL，置10mL量瓶中，加入20%甲醇水至刻度，即得5個(gè)化合物質(zhì)量濃度均為10μg／mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，其他不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液由混合對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，即得。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 采用Kinnetex C18（2.1mm×100mm，2.6μm）色譜柱，以流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%氨水（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%A；0.5～2.0 min，10%A→95%A；2.0～5.0 min，95%A；5.0～5.3 min，95%A→10%A；5.3～7.0 min，10%A），流速0.25mL／min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源的負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為3.50 kV，脫溶劑氣流為氮?dú)?00 L／h，脫溶劑溫度500℃，錐孔氣流：氮?dú)?50 L／h，離子源溫度：150℃，二級(jí)錐孔萃取電壓：3.00 V，碰撞氣體：氬氣，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，5個(gè)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 UPLC-MS／MS定量方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品稀釋液（100倍）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，5個(gè)黃酮成分間分離良好，未有雜質(zhì)干擾，供試品稀釋液和對(duì)照品的質(zhì)譜圖兩者一致（圖1），表明本法專屬性良好。

圖1 混合對(duì)照品（A）和供試品（B）的UPLC-MS／MS色譜圖

2.3.2 線性和范圍 取“2.2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用20%甲醇稀釋為5、10、20、50、80、100、150、200和500 ng／mL的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件，進(jìn)樣分析。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取0.10μg／mL的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行峰面積測(cè)定（測(cè)定條件同“2.1”項(xiàng)下），測(cè)定結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚5個(gè)黃酮類成分的峰面積RSD分別為2.0%、1.7%、0.82%、1.3%、2.3%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取0.10μg／mL的混合對(duì)照品溶液，在0、2、6、10、12和24 h測(cè)定和在不同日期（3 d內(nèi)的同一時(shí)間）測(cè)定，除了山奈酚只在6 h內(nèi)穩(wěn)定以外，其他成分的日內(nèi)RSD均小于3.0%，日間RSD均小于5%；另取處理后的供試品溶液，在1日內(nèi)的0、2、6、10、12和24 h測(cè)定，5種成分的RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，能滿足定量分析要求。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批鼠曲草樣品（產(chǎn)地：安徽亳州）6份，制備方法同“2.2.1”項(xiàng)下，條件同“2.1”項(xiàng)下，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚的平均含量分別為8.10、126.00、511.20、217.80、3.00μg／g，RSD分別為2.3%、1.9%、1.5%、1.8%、2.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份鼠曲草樣品（產(chǎn)地：安徽亳州），每份約1g，分別加入折算質(zhì)量為本底量100%的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，記錄峰面積并計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，5個(gè)黃酮類成分的平均回收率98.93%～100.1%，RSD為0.56%～2.2%（n＝6），表明該方法的準(zhǔn)確度較好，見(jiàn)表3。

表3 5個(gè)黃酮類成分的回收率及RSD（n＝6）

2.3.7 樣品含量測(cè)定 精密稱取鼠曲草樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。結(jié)果顯示6批鼠曲草的5個(gè)化學(xué)成分的含量波動(dòng)明顯，說(shuō)明這6批鼠曲草產(chǎn)地不同，質(zhì)量存在差異性，見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察 本研究在樣品前處理后，通過(guò)加內(nèi)標(biāo)考察了基質(zhì)效應(yīng)［13］，由測(cè)得的濃度計(jì)算含量，再對(duì)應(yīng)加標(biāo)的量來(lái)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然基質(zhì)對(duì)測(cè)定的5個(gè)成分有一定的抑制作用，但抑制效應(yīng)較?。ň∮?0%），可能是由于樣品是在稀釋了較大倍數(shù)后再進(jìn)樣檢測(cè)，所以基質(zhì)對(duì)于所測(cè)定成分的定量影響并不大，因此可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本方法定量的影響。

表4 不同產(chǎn)地6批樣品的5個(gè)成分的平均含量（n＝3） μg／g

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品稀釋倍數(shù) 金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚4種對(duì)照品在濃度達(dá)到0.15μg／mL時(shí)，響應(yīng)較差，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線最大濃度選擇為0.10μg／mL。通過(guò)預(yù)試，金絲桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚4個(gè)黃酮成分在樣品中的含量較高，而蘆丁含量低，為了使測(cè)定結(jié)果在線性范圍內(nèi)，最終確定將樣品稀釋100倍后進(jìn)樣測(cè)定上述4個(gè)黃酮成分，而蘆丁含量的測(cè)定則選擇“2.2.1”項(xiàng)下未稀釋的供試品溶液。

3.3 提取條件的考量 對(duì)比超聲提取和回流提取兩種方法，對(duì)于本研究中的5個(gè)成分，結(jié)果顯示差異并不明顯，考慮到經(jīng)濟(jì)和效率因素，決定采用超聲提取法。另外，比較甲醇和乙醇提取及其不同純度、提取倍量的效果，結(jié)果表明60%乙醇作為提取溶劑，提取倍量為60倍時(shí)提取效果最佳。在確定了提取溶劑與體積后，本研究進(jìn)一步考察了提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，鼠曲草的最佳提取條件為料液比1∶60、采用60%乙醇超聲提取30 min，提取2次。

3.4 色譜條件的選擇 分別考察了Kinnetex C18色譜柱（2.1mm×100mm，2.6μm）、Shim-pack XR-ODSⅢ色譜柱（2.0mm×75mm，1.6μm）、Thermo C18（2.1mm×150mm，2μm）和Agilent Zorbax C18（100mm×2.1mm，2μm）、Waters Cortecs C18（2.1mm×100mm，1.6μm）對(duì)鼠曲草5個(gè)成分的分離效果，結(jié)果表明Kinnetex C18色譜柱（2.1mm×100mm，2.6μm）的分離度和靈敏度比其他色譜柱高。先后考察了4種流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%氨水、乙腈-水、甲醇-0.1%氨水、甲醇-水），結(jié)果乙腈-0.1%氨水最佳，僅僅7 min即實(shí)現(xiàn)了鼠曲草中5個(gè)成分的分離定量，單針樣品所消耗的流動(dòng)相不足2mL，明顯優(yōu)于高效液相色譜法。

3.5 質(zhì)譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)綜合考察了5個(gè)黃酮類成分在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)情況，結(jié)果顯示負(fù)離子模式響應(yīng)較好，因此選擇該監(jiān)測(cè)模式。通過(guò)優(yōu)化每個(gè)化合物的MRM條件，從而挑選出最佳的定量離子對(duì)。實(shí)驗(yàn)選擇2對(duì)高離子豐度、低基線噪聲的離子對(duì)用以定性，選擇最高離子豐度的離子對(duì)用以定量；并在此基礎(chǔ)上，對(duì)影響靈敏度較大的碰撞能量和源內(nèi)碎裂電壓進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，使所選的子離子組成的特征離子達(dá)到最佳的豐度和比例。

本實(shí)驗(yàn)研究了6批不同產(chǎn)地鼠曲草，所含的5個(gè)黃酮類化合物含量雖存在一定差異，嘗試從經(jīng)緯度、氣候等方面進(jìn)行分析，但并未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律性，這提示這種含量差異可能是由產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工和儲(chǔ)藏方式等多因素綜合影響所造成的，而本研究?jī)H測(cè)定了少數(shù)幾個(gè)產(chǎn)地樣品，后續(xù)可增加樣本量，并對(duì)可能影響含量的其他因素進(jìn)行更深入的研究。本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定鼠曲草藥材中5個(gè)黃酮類成分，為鼠曲草藥材成分全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種快速、高效的分析方法，為綜合評(píng)價(jià)鼠曲草藥材質(zhì)量提供參考。