迷迭香酸對脂多糖誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎癥的影響

余 意，陳建雄，管江麗，祁克明，魏藝聰，盧 偉*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州350122）

神經(jīng)炎癥是發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)的特殊免疫應(yīng)答，它與許多腦部神經(jīng)疾病的發(fā)展緊密相關(guān)，如多發(fā)性硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等［1］。神經(jīng)炎癥的發(fā)生常常伴隨著促炎細(xì)胞因子水平的升高［2-3］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道免疫防線，在免疫異常所誘發(fā)的各種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的固有免疫細(xì)胞，也是神經(jīng)系統(tǒng)中專職的巨噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)免疫監(jiān)控、抗原呈遞、吞噬碎片、分泌調(diào)節(jié)性免疫分子等［4］。而在病理條件下，炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等會大量表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），從而誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的NO，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，所以iNOS被認(rèn)為是一種“病理型”的酶［5］。因此，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞受到外界刺激而被激活后，會釋放NO等神經(jīng)毒性物質(zhì)和各種炎性細(xì)胞因子，這些物質(zhì)往往會引起炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，若得不到及時清除，最終會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［6-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）系酚酸類化合物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫抑制、保護神經(jīng)元等多種生理活性［9-12］。本研究旨在通過RA干預(yù)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠及BV2細(xì)胞實驗，探究RA對LPS誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎癥的影響以及對BV2炎癥反應(yīng)的影響，以期為RA在新藥的開發(fā)以及相關(guān)疾病的治療上提供實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6～8周的C57BL／6雄性小鼠39只，體質(zhì)量（22±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：CXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室，使用許可證號：SYXK（閩）2014-005。24 h恒溫（21～23℃）恒濕（55%～75%），模擬自然晝夜變化（6∶00—18∶00給予光照，其他時間為黑夜?fàn)顟B(tài)），自由飲水飲食。

1.2 細(xì)胞株 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞株通過上海復(fù)祥生物科技有限公司采購于American Type Tissue Culture Collection（ATCC）。

1.3 實驗試劑 迷迭香酸（北京百靈威科技有限公司，純度≥98%，貨號：547770）；脂多糖（美國Sigma公司，貨號：L2630）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：C11875500BT、10099141）；Penicillin-Streptomycin Solution、Phosphate Buffered Saline（美國Hyclone公司，貨號：sv30010、SH30256.01）；iNOS抗體（美國SANTA CRUZ公司，貨號：sc-650）；β-actin抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：HC201）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京依瑪博科技有限公司，貨號：EM35110，EM35111，按1∶20000稀釋）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0018A）；一氧化氮測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2-1）；Mouse IL-6 ELISA Kit（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0411）；Mouse IL-1beta ELISA Kit（上海恪敏生物科技有限公司，貨號：EM001-96）。

1.4 實驗儀器 Nfinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）；HERACELL 150i細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（AIRTECH）；Centrifuge5418高速離心機（Eppendorf）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；EX224電子天平（OHAUS）；Carl Zeiss AG激光共聚焦顯微鏡（Oberkochen，Germany）。

2 實驗方法

2.1 干預(yù)與造模 C57BL／6小鼠購進適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成對照組、LPS組、LPS＋RA低劑量組、LPS＋RA中劑量組、LPS＋RA高劑量組，每組各6只，用于分子指標(biāo)檢測。將RA溶于生理鹽水，LPS＋RA低劑量組、LPS＋RA中劑量組、LPS＋RA高劑量組于麻醉前30 min分別按40、60、80mg／kg腹腔注射RA溶液。水合氯醛用生理鹽水溶解，按400mg／kg進行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉后，剪開頭皮，查找前囪點，以前囪為原點，向后0.2～0.5mm，統(tǒng)一向右旁開1.0～1.5mm切口，深度2.0～3.0mm，以0.1μL／s的速度進行側(cè)腦室注射，LPS給藥量為100μg／kg，停針30 s使藥物擴散。注射完后縫合切口，并在切口處涂慶大霉素以防止感染，并涂苦味酸防止互咬傷口，放回籠中飼養(yǎng)24 h。斷頭取腦（去除嗅球、小腦和腦干），放入液氮中保存。研缽高溫烘烤滅菌后，將腦組織在研缽里加液氮研成粉末。將粉末按100 mg每管分裝到無菌無酶EP管中，放入液氮保存。

2.2 大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察 隨機選取9只小鼠，分為對照組、LPS組、LPS＋RA高劑量組，按“2.1”步驟給藥，24 h后進行麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，然后用鑷子提起心尖將針頭插入左心室，剪穿右心耳，緩慢注射生理鹽水進行灌流，至肺和肝的顏色都變成灰白色。換用4%的多聚甲醛灌注至小鼠四肢僵硬。斷頭取腦，置于多聚甲醛固定24 h。進行常規(guī)的石蠟包埋，按厚度5μm進行冠狀切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.3 免疫熒光實驗 受試腦切片用0.5%Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室溫下封閉2 h后，加入兔抗iNOS一抗（1∶200），4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育60 min PBS洗滌后，滴加3mg／L的DAPI，避光孵育5 min，對標(biāo)本進行核染，洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%Penicillin-Streptomycin雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞超過80%匯合度時，進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。按2×105／mL濃度將細(xì)胞接種于六孔板中，每孔2mL，培養(yǎng)24h，細(xì)胞密度約80%，換含1%胎牛血清含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)。給藥終濃度分別為LPS 100 ng／mL，RA 50、100、200μmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá)變化 小心吸去培養(yǎng)液，向每孔中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 1mL提取總RNA，用移液槍吸取液體反復(fù)吹打，使細(xì)胞能夠充分裂解。將充分裂解的溶液小心移入無菌無酶EP管中，按試劑盒方法進行總RNA的提取。GAPDH：上游CAACGGGAAACCCAT CACCA，下游ACGCCAGTAGACTCCACGACAT；CD14：上游AAACTCGCTCAATCTGTCTTTCACT，下游GGG TTCCTATCCAGCCTGTTGT；CD44：上游TGGGTTCA TAGAAGGAAATGTGGTA，下游TGTCATAGTGGGA GGTGTTGGA；MCP-1：上游CCACTCACCTGCTGCT ACTCATT，下游GTATGTCTGGACCCATTCCTTCTTG；MIP-1α：上游GCTCCCAGCCAGGTGTCATTTT，下游AAGACTCTCAGGCATTCAGTTCCAG。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR Select Master Mix試劑盒進行qPCR。

2.6 NO濃度測定 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每孔細(xì)胞中加入200μL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后收集于離心管中。兩者經(jīng)離心后用NO測定試劑盒測定NO濃度。

2.7 Western blot法檢測iNOS蛋白表達(dá) 小心吸去培養(yǎng)液，向每孔加入150μL含PMSF的RIPA裂解液，反復(fù)吹打后離心，取上清。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)齊濃度，向樣品蛋白中加入適量5×Loading Buffer使混合溶液終濃度為1×。震蕩混勻后100℃變性10 min，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（iNOS抗體1:200；β-actin抗體1:1000）、孵育二抗（1:20000）后進行顯影，用Image Lab軟件進行分析處理，以目的蛋白的灰度和βactin灰度的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 RA對LPS引起小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變的影響 采用HE染色觀察小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變。如圖中虛框所示，對照組小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞沒有明顯變化，細(xì)胞排列較為緊密整齊，層次較多，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯。LPS組小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏散亂，少量細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清晰，呈不規(guī)則狀，有固縮情況。RA給藥組能夠明顯改善LPS引起的改變，見圖1。

3.2 RA對LPS引起小鼠大腦中細(xì)胞炎性基因表達(dá)的影響 免疫熒光檢測結(jié)果顯示，對照組iNOS表達(dá)量很低，LPS組小鼠大腦中海馬區(qū)中iNOS表達(dá)顯著增加，而在RA干預(yù)后，iNOS的表達(dá)明顯降低，見圖2。qPCR法檢測結(jié)果顯示，LPS單獨刺激會增加CD14、CD44、MCP-1與MIP-1αmRNA的表達(dá)，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加 的表達(dá)，見圖3。

圖1 小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色圖（×200）

圖2 小鼠大腦海馬區(qū)iNOS免疫熒光圖（×200）

圖3 RA對LPS誘導(dǎo)小鼠大腦中CD14、CD44、MCP-1和MIP1αmRNA表達(dá)影響

3.3 RA對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的NO濃度和iNOS蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測iNOS表達(dá)變化情況，正常情況下，iNOS表達(dá)量很低，在LPS刺激下表達(dá)增加，而在RA干預(yù)后，iNOS的表達(dá)降低，且呈明顯的量效關(guān)系，見圖4。

圖4 RA對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的NO濃度和iNOS蛋白表達(dá)的影響

3.4 RA對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥基因表達(dá)的影響 結(jié)果顯示LPS單獨刺激會增加CD14、CD44 mRNA的表達(dá)，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加的表達(dá)，見圖5。

4 討論

已有研究表明，在正常生理條件下，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的NO在神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞及大腦的學(xué)習(xí)記憶生理過程中發(fā)揮著重要作用。但當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受刺激而產(chǎn)生和釋放過量NO時，過量的NO會引起神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)。過多的NO擴散至細(xì)胞外后，激活鄰近的突觸引起一系列反應(yīng)使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載引起不良反應(yīng)，而鈣離子超載是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因之一。此外，過多的NO能抑制神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體，致使谷氨酸在神經(jīng)元外滯留，從而引起神經(jīng)元的谷氨酸興奮性不良反應(yīng)。過多的NO除了自身有不良反應(yīng)外，其衍生物特別是過氧硝酸鹽能夠引起腦部更嚴(yán)重的損害，甚至?xí)?dǎo)致血腦屏障破壞［13-14］。在NOS中，iNOS是神經(jīng)細(xì)胞受刺激損傷后產(chǎn)生過量NO的主要誘導(dǎo)酶，在神經(jīng)炎癥狀態(tài)，大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星性膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS的表達(dá)顯著提高，因此，iNOS常作為神經(jīng)炎癥的標(biāo)志物。已有研究表明，iNOS可調(diào)控CD14和CD44的表達(dá)，而CD14是一類具有比較廣泛配體特異性和模式識別功能的受體，能夠識別多種微生物產(chǎn)物特別是LPS并引起炎癥反應(yīng)，CD44是透明質(zhì)酸的主要受體，CD44與透明質(zhì)酸的相互作用在炎癥過程中起重要的作用，CD14和CD44的擴大表達(dá)可導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，在神經(jīng)炎性損傷中具有重要作用［15-17］。另外，MCP-1與MIP-1α等趨化因子等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞的聚集，浸潤的炎性細(xì)胞進一步釋放這些細(xì)胞因子和趨化因子，引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的進一步活化，從而產(chǎn)生炎癥信號級聯(lián)擴大反應(yīng)，釋放各種細(xì)胞毒性成分，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷。因此，發(fā)現(xiàn)及研發(fā)抑制iNOS過量表達(dá)的藥物，對治療NO引起的神經(jīng)損傷及腦部疾病具有重要意義。

圖5 迷迭香酸對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的CD14和CD44 mRNA表達(dá)的影響

神經(jīng)炎癥具有雙向調(diào)節(jié)作用，一方面在維持機體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用；另一方面當(dāng)反應(yīng)過度時，則會損傷腦部神經(jīng)及器官。本研究利用側(cè)腦室注射LPS（100μg／kg）建立神經(jīng)炎癥小鼠模型，給迷迭香酸（40、60、80mg／kg）治療后，迷迭香酸能夠改善LPS誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥，并且在體內(nèi)與體外實驗均表明迷迭香酸可有效抑制神經(jīng)炎癥。本研究顯示迷迭香酸對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥具有明顯的改善作用，表明迷迭香酸對神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的預(yù)防和治療方面具有重要的研究價值。