基于TLR4／NF-κB信號(hào)通路研究甘草瀉心湯治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的機(jī)制

張建偉，陳橋英，陳 儀

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的慢性炎癥性腸道疾病，隨著社會(huì)快速發(fā)展、生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病率最低估算約為11.60／10000［1］。研究發(fā)現(xiàn)TLR4／NF-κB是潰瘍性結(jié)腸炎的重要信號(hào)通路之一，TLR4與炎癥和免疫息息相關(guān)，NF-κB作為T(mén)LR4信號(hào)通路下游重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，激活后在機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起樞紐作用。因此本文旨在通過(guò)對(duì)TLR4／NF-κB炎癥通路的深入研究，探討甘草瀉心湯對(duì)UC的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠42只，體質(zhì)量200 g左右，鼠齡8周，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 甘草瀉心湯［2］按原方比例：生甘草12g，半夏9g，干姜9g，黃芩9g，黃連3g，人參9g，大棗6g，購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。柳氮磺吡啶腸溶片（上海福達(dá)制藥有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 2，4-二硝基氯苯、水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無(wú)水乙醇、丙酮、冰乙酸（西隴化工股份有限公司）；過(guò)氧化氫（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；液體石蠟、蘇木素伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；硫化鈉（天津恒興化試劑發(fā)展有限公司）；無(wú)菌PBS緩沖液（美國(guó)HyClone公司）；生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）；白介素-6（IL-6）、IL-8 ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；IL-10 ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D公司）；NF-κB p65（Ab-536）Antibody、TLR4 Antibody（美國(guó)Signalway Antibody）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 RM2135切片機(jī)、LeicaDM400B顯微圖像采集系統(tǒng)、生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；TB-718E生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（湖北泰維醫(yī)療科技實(shí)業(yè)有限公司）；ZT-12JI生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、YT-7FB生物組織攤烤片機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 42只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥組、甘草瀉心湯低劑量組（低劑量組）、甘草瀉心湯中劑量組（中劑量組）、甘草瀉心湯高劑量組（高劑量組），每組各7只。除空白組外，其他各組參照江學(xué)良復(fù)合法并稍加改進(jìn)［3］，用2，4-二硝基氯苯和醋酸復(fù)合法建立大鼠UC模型。操作：頸背部用6%Na2S脫毛，每日用2%的2，4-二硝基氯苯丙酮液滴背1次，每次0.3mL，連續(xù)14 d。第15天用潤(rùn)滑后直徑約3mm的尼龍導(dǎo)管經(jīng)肛門(mén)插入結(jié)腸約8cm處，注入0.04mmol／L（0.1%）的2，4-二硝基氯苯乙醇液（50%）0.25mL，第16天注入8%醋酸溶液2mL，精確定時(shí)15 s后，用5mL生理鹽水沖洗。造模完成后常規(guī)飲食，不予任何干預(yù)，觀察2 d。空白組造模前后均常規(guī)飲食，不給予任何干預(yù)。

2.2 干預(yù) 造模后第3天開(kāi)始給藥，連續(xù)14 d，各治療組均以相應(yīng)藥物灌胃。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》［4］計(jì)算，成人體質(zhì)量按60 kg估算，成人向大鼠的用藥換算系數(shù)為6.17。低、中、高劑量組分別按2.93、5.86、11.72 g／（kg·d）予甘草瀉心湯藥液灌胃；西藥組按0.31 g／（kg·d）予柳氮磺吡啶藥液灌胃；空白組不予干預(yù)，自由飲食；模型組予同等體積蒸餾水灌胃。各組每日灌胃1次，連續(xù)干預(yù)14 d。

2.3 取材 灌藥觀察14 d后，禁食24 h取材，所有大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-20℃低溫冰箱保存。取距肛緣8cm處的結(jié)腸，沿縱軸剖開(kāi)觀察，剪取病變嚴(yán)重處黏膜組織，生理鹽水沖洗干凈，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 結(jié)腸組織HE染色 結(jié)腸組織蠟塊，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)，拍片留取。

2.4.2 檢測(cè)指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法測(cè)定血清炎IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平。免疫組化法分析檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織TLR4、NF-κB p65的表達(dá)，具體方法和步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)完成情況 模型組大鼠因藥物反應(yīng)死亡1只，高劑量組大鼠因灌胃手法不當(dāng)，戳穿氣管，死亡1只。

3.2 對(duì)結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響 空白組黏膜上皮結(jié)構(gòu)完好、清晰，細(xì)胞排列均勻，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組黏膜上皮壞死脫落嚴(yán)重，局部糜爛、潰瘍，固有層內(nèi)腺體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，間質(zhì)充血水腫明顯，多數(shù)結(jié)腸黏膜下層可見(jiàn)大片彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組病變均較模型組有所減輕，尤其是高劑量組、西藥組與模型組比較，黏膜各層結(jié)構(gòu)更為清晰，黏膜上皮的潰瘍或糜爛，間質(zhì)的充血水腫及下層的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)都有不同程度的好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 6組大鼠結(jié)腸組織HE染色病理圖（×200）

3.3 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平比較（±s）pg／mL

表1 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平比較（±s）pg／mL

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與中劑量組比較，3）P＜0.05。

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n 767776 IL-68.32±3.5226.86±4.281）3.72±2.991）2）3）5.36±2.652）3）12.85±3.811）2）2.67±0.491）2）3）IL-8119.92±11.45153.92±16.361）99.71±12.181）2）3）123.92±15.782）123.92±6.172）119.03±18.422）IL-1013.38±4.157.71±3.051）7.66±0.671）3）11.44±3.143）17.97±4.831）2）12.28±2.072）3）

3.4 6組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)比較（±s）

表2 6組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.01。

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組TLR40.137±0.0180.534±0.0251）0.271±0.0291）3）0.268±0.0411）3）0.228±0.0311）3）0.217±0.0633）NF-κB p650.086±0.0160.464±0.061）0.154±0.011）3）0.231±0.0461）3）0.156±0.0161）3）0.127±0.0172）3）

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與遺傳因素以及免疫功能失調(diào)密切相關(guān)［5］。隨著對(duì)免疫系統(tǒng)越來(lái)越多的深入研究，發(fā)現(xiàn)TLRs家族中的TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是UC發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，NF-κB作為T(mén)LR4信號(hào)通路下游重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，激活后在機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起樞紐作用［6-7］?；罨腘F-κB可促進(jìn)IL-6、IL-8等炎癥細(xì)胞因子大量分泌。這些細(xì)胞因子又進(jìn)一步激活NF-κB，形成正反饋調(diào)節(jié)，使炎癥反應(yīng)放大［8］。因此調(diào)節(jié)TLR4／NF-κB信號(hào)通路可能是治療UC的主要靶點(diǎn)［9］。

多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為UC屬于中醫(yī)“痢疾”“泄瀉”等疾病范疇，脾胃虛弱、濕熱內(nèi)蘊(yùn)，寒熱錯(cuò)雜、虛實(shí)夾雜是其主要病機(jī)。甘草瀉心湯出自《金匱要略》，由半夏瀉心湯重用生甘草化裁而來(lái)，方中重用生甘草為君取其清熱解毒；黃芩、黃連協(xié)助生甘草瀉火，燥濕清熱；半夏、干姜溫中健脾燥濕；人參、大棗補(bǔ)中益氣。全方辛開(kāi)苦降，寒溫并用，升清降濁，既使中州得健以扶正，又清熱祛濕以祛邪。現(xiàn)代藥理研究證明，甘草瀉心湯保護(hù)消化道黏膜的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)理腸道菌群、抑制炎性信號(hào)通路、修復(fù)黏膜細(xì)胞等作用，從而達(dá)到防治消化道黏膜炎癥的目的［10］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯聯(lián)合西藥具有修復(fù)UC患者腸黏膜屏障，改善腸黏膜通透性，恢復(fù)腸道菌群多樣性等方面的作用［11-12］。

本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘草瀉心湯能明顯改善UC大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)炎性改變，降低TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)，抑制血清促炎性因子IL-6、IL-8水平，進(jìn)而上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，表明甘草瀉心湯可通過(guò)對(duì)TLR4／NF-κB炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)而發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TLR4活性，以阻止其下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，阻礙其信號(hào)傳遞，降低促炎性因子IL-6、IL-8的產(chǎn)生，進(jìn)而上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平，減少炎癥反應(yīng)，表明甘草瀉心湯具備一定程度的抗炎、抗?jié)?、保護(hù)黏膜、改善水腫充血等作用，從而改善腸道功能，其中甘草瀉心湯高劑量組的療效及各種調(diào)節(jié)作用較為顯著。