“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)配伍前后指紋圖譜變化及其多指標(biāo)成分的定量分析*

莊星星，倪受東，陳明，苗仁華，張鵬，李萌

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院 安徽巢湖 238000

細(xì)辛、干姜兩味中藥均首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》 “細(xì)辛，味辛，性溫。主咳逆，頭痛，腦動(dòng)，百節(jié)拘攣，風(fēng)濕痹痛，死機(jī)”具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲的功效[1]。“干姜，味辛，性溫。主胸滿，咳逆上氣，溫中止血，出汗，通神明，生川谷”具有溫中散寒，回陽(yáng)通脈，溫肺化飲的功效[2]。“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)配伍最早見于漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的小青龍湯。細(xì)辛溫中下氣，破痰利水道，干姜溫通上焦心肺，兩藥配伍達(dá)到溫肺化飲的功效[3]?！吨兴幏絼?shù)據(jù)庫(kù)》中檢索出含“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)的方劑約273首，臨床主治癥廣泛，其中以呼吸系統(tǒng)的疾病，如咳喘、痰飲以及風(fēng)寒感冒最為多見[4]。

藥理學(xué)研究表明“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)可有效降低COPD大鼠血清TNF-a和IL-8 含量，升高 IL-2 含量，改善肺功能，減輕氣道炎癥，延緩或打斷 COPD 的發(fā)展，藥對(duì)藥效優(yōu)于單味中藥[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也表明細(xì)辛、干姜兩藥配伍使用具有協(xié)同作用，隱亭、芝麻脂素和鄰苯二甲酸二丁脂可能是藥對(duì)功效機(jī)理發(fā)揮的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；前列腺素G/H合酶2、β2-腎上腺素能受體、促細(xì)胞分裂蛋白激酶2和熱激蛋白90可能是藥對(duì)活性成分發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)[6]。

課題組前期研究和文獻(xiàn)資料調(diào)研的基礎(chǔ)上，以細(xì)辛中的主要活性成分細(xì)辛脂素、芝麻脂素[7]和干姜中的6-姜酚、6-姜烯酚[8]為指標(biāo)，結(jié)合HPLC特征指紋圖譜，定量分析“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)配伍前后藥材中指標(biāo)成分的含量變化以及定性分析指紋圖譜變化，從化學(xué)層面探討藥對(duì)配伍的可能機(jī)理。

儀器與材料

1 儀器

1260 II高效液相色譜儀配置四元泵、VWD檢測(cè)器、OpenLAB工作站（美國(guó) Agilent公司）；BT25S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；FA1204B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KMD-500調(diào)溫電熱套（金壇市鴻科儀器廠）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL16E高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）；JK100B超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）。

2 材料

細(xì)辛脂素對(duì)照品（20mg/支，純度：99.70%，批號(hào)：DC-19080704）；芝麻脂素對(duì)照品（20mg/支，純度：99.75%，批號(hào)：DC-19111607）；6-姜酚對(duì)照品（20mg/支，純度：99.69%，批號(hào)：DC-19040810）6-姜烯酚對(duì)照品（20mg/支，純度：99.70%，批號(hào)：DC-19061204）購(gòu)自南京滴純生物科技有限公司。細(xì)辛飲片和干姜飲片購(gòu)自亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倪受東副主任中藥師鑒定分別為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag. 的干燥根和根莖和姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，藥材產(chǎn)地和批號(hào)見表1。

甲醇（色譜純，批號(hào)：20180302，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）；超純水由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

表1 藥材的產(chǎn)地和批號(hào)信息

方法和結(jié)果

1 供試液制備

稱取細(xì)辛、干姜各12.0 g，根據(jù)前期正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳水提取工藝：浸泡浸泡1小時(shí)，加6倍量水（首煎考慮藥材吸水率，加水量為8倍），提取2 h，提取3次。所得提取液混合濃縮定容至50.0 mL 容量瓶中。細(xì)辛和干姜單煎液分別標(biāo)記細(xì)辛S1-S10和干姜S1-S10，細(xì)辛-干姜混煎液標(biāo)記混煎S1-S10。備用。

精密吸取濃縮液各10.0 mL 分別置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?5%甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜濾過，轉(zhuǎn)移至10.0 mL量瓶中，超聲30 min，冷卻后定容，備用。

2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取細(xì)辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚適量，分別置于不同容量瓶中，甲醇溶解，制成濃度1.0 mg/mL的細(xì)辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚對(duì)照品溶液。

精密吸取濃度細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液200μL、芝麻脂素對(duì)照品溶液100μL、6-姜酚對(duì)照品溶液200.00μL和6-姜烯酚對(duì)照品溶液200.00μL置于同一100mL容量瓶，甲醇定容，制成細(xì)辛脂素濃度2.00μg/mL、芝麻脂素濃度1.00μg/mL、6-姜酚濃度2.00μg/mL和6-姜烯酚濃度2.00μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

3 指紋圖譜建立及分析

3.1 色 譜 條 件 Agilent EC-C18（4.6×150mm，4μm）；柱溫 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相為甲醇和水，洗脫程序：0～15min，25%甲醇；15 ～ 30min，25%~50% 甲醇；30 ～ 45min，50%甲 醇；45～ 46min，50% ～ 25% 甲 醇；46～ 50min，25%甲醇。進(jìn)樣量：40μL。

3.2 精密度試驗(yàn) 取“1”項(xiàng)下所得供試品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，建立指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1”項(xiàng)下所得供試品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下分別于 0、1、2、4、8、16、24 h 依次進(jìn)樣檢測(cè)，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 RSD 均＜3%，表明24h 內(nèi)供試品溶液的成分穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取細(xì)辛、干姜各12.0 g，按“1供試液制備”方法平行制備供試品溶液6份，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 RSD 均＜3%，表明重復(fù)性良好。

3.5 指紋圖譜的建立 將“1”項(xiàng)下所得供試液和“2”項(xiàng)下所得混合對(duì)照品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)，分別得到10批細(xì)辛單煎液、10批干姜單煎液、10批細(xì)辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜以及混合對(duì)照品指紋圖譜。將所得的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜?；旌蠈?duì)照品HPLC圖譜、10批細(xì)辛單煎液、10批干姜單煎液以及10批細(xì)辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜見圖1-4。

3.6 配伍前后指紋圖譜的變化分析 建立10批細(xì)辛HPLC指紋圖譜，確定了9個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品HPLC圖譜對(duì)比，確定6號(hào)峰為芝麻脂素，7號(hào)峰為細(xì)辛脂素，見圖2。建立10批干姜HPLC指紋圖譜，確定了13個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品HPLC圖譜對(duì)比，確定8號(hào)峰為6-姜酚，11號(hào)峰為6-姜烯酚，見圖3。

建立10批細(xì)辛-干姜混煎液HPLC指紋圖譜（見圖4），確定了17個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品HPLC圖譜對(duì)比，確定9號(hào)峰為6-姜酚，，12號(hào)峰為芝麻脂素，13號(hào)峰為細(xì)辛脂素，14號(hào)峰為6-姜烯酚。通過對(duì)比細(xì)辛、干姜單煎液和細(xì)辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜，對(duì)藥對(duì)HPLC指紋圖譜確定的17個(gè)峰進(jìn)行初步歸屬：3、7、11、12、16 號(hào)峰來源于細(xì)辛；1、2、4~6、8~10、14、15、17號(hào)峰來源于干姜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥對(duì)共煎的過程中沒有含量較大的組方產(chǎn)生或消失。細(xì)辛、干姜單煎液HPLC指紋圖譜中部分面積較小的峰，在藥對(duì)共煎液的HPLC指紋圖譜中并未出現(xiàn)，可能是共煎過程中影響了該類成分的溶出，見圖4。

4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

4.1 線性關(guān)系考察 按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，將“2”項(xiàng)下所得混合對(duì)照品溶液，甲醇稀釋至 0、2、4、8、16、32倍，制成系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣40μL，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，得6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍。結(jié)果見表2。

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 10批細(xì)辛藥材HPLC指紋圖譜

圖3 10批干姜藥材HPLC指紋圖譜

4.2 精密度試驗(yàn) 取“2”項(xiàng)所得混合對(duì)照品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各指標(biāo)性成分峰面積。結(jié)果6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為0.96%、1.09%、1.13%、1.32%，說明儀器精密度良好。

圖4 10批“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)HPLC指紋圖譜

表2 各指標(biāo)性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2”項(xiàng)下所得混合對(duì)照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于 0、2、4、8、16、24 h 依次進(jìn)樣。結(jié)果6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為0.36%、0.87%、0.92%、0.54%，說明混合對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取細(xì)辛、干姜各12.0 g，按“2.1”項(xiàng)方法，平行制備供試品溶液6份，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果結(jié)果6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為2.31%、2.85%、3.06%、3.32%，說明方法重復(fù)性良好。

5 樣品含量測(cè)定

取“1”項(xiàng)下所得10批細(xì)辛單煎液、10批干姜單煎液、10批細(xì)辛-干姜混煎液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算供試品溶液細(xì)辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚濃度。用SPSS17.0對(duì)不同組別間的濃度測(cè)定結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異具有顯著性。

“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)混煎中6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚的濃度較藥材單煎液中的濃度相當(dāng)，說明細(xì)辛和干姜混煎過程中部分指標(biāo)性成分的溶出度未見明顯變化。結(jié)果見表3。

討 論

中藥藥對(duì)研究是方劑研究的基礎(chǔ)，是闡明中醫(yī)遣藥組方機(jī)理的重要途徑。相比簡(jiǎn)單單味中藥，藥對(duì)的配伍機(jī)理研究更能體現(xiàn)中醫(yī)的“藥”和“方”的科學(xué)內(nèi)涵。中藥藥對(duì)的研究作為研究熱點(diǎn)，學(xué)者們通過研究中醫(yī)方劑中常見的中藥藥對(duì)，發(fā)現(xiàn)藥對(duì)的配伍機(jī)理主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：一是化學(xué)成分變化，藥對(duì)經(jīng)過配伍后，由于兩藥之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使得主要藥效成分的溶出率[9]發(fā)生變化，或者產(chǎn)生新的藥效成分[10]；二是藥動(dòng)學(xué)改變，藥對(duì)經(jīng)過配伍后，由于中藥成分復(fù)雜，各成分之間在體內(nèi)發(fā)生相互作用或者影響體內(nèi)主要代謝酶活性使得主要活性成分體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程發(fā)生了改變[11-12]。三是藥理學(xué)變化，藥物配伍后由于化學(xué)成分間的相互作用，使得藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變，使得進(jìn)入機(jī)體組織或者細(xì)胞后作用的靶點(diǎn)增多，通過不同生化通路起到協(xié)同作用從而增強(qiáng)藥理作用[13]。

表3 細(xì)辛、干姜配伍前后指標(biāo)性成分的含量測(cè)定結(jié)果（，n=10）μg/mL

表3 細(xì)辛、干姜配伍前后指標(biāo)性成分的含量測(cè)定結(jié)果（，n=10）μg/mL

樣品 細(xì)辛脂素 芝麻脂素 6-姜酚 6-姜烯酚細(xì)辛單煎液 0.1655±0.0069 0.1346±0.0136 － －干姜單煎液 － － 0.1148±0.0270 0.2522±0.798藥對(duì)混煎液 0.1768±0.0083 0.1388±0.0213 0.1238±0.0301 0.2368±0.1185

“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)配伍前后的指紋圖譜變化進(jìn)行分析，藥對(duì)指紋圖譜主要貢獻(xiàn)來自于干姜。細(xì)辛單煎液的HPLC指紋圖譜確定了9個(gè)共有峰，干姜單煎液的HPLC指紋圖譜確定了13個(gè)共有峰。藥對(duì)混煎液的HPLC指紋圖譜確定了17個(gè)共有峰，其中12個(gè)來源于干姜，5個(gè)來源于細(xì)辛，提示細(xì)辛和干姜在配伍后，多數(shù)特征成分的溶出度未見明顯變化。歸屬性分析提示藥對(duì)混煎液的HPLC指紋圖譜沒有新增的物質(zhì)峰產(chǎn)生，說明藥材中的化學(xué)成分之間相對(duì)穩(wěn)定。藥對(duì)混煎液中的指標(biāo)性成分6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚濃度和藥材單煎液中的濃度相當(dāng)，說明在藥對(duì)混煎過程中，雖然各藥材中的化學(xué)成分相互影響，作為主要指標(biāo)性成分的溶出度未見明顯變化，“細(xì)辛-干姜”藥對(duì)的配伍機(jī)理需要進(jìn)一步研究。