無芒隱子草葉片卷曲度和厚度測量方法

張文霞 王春光 王海超 殷曉飛 宗哲英

(1.鄂爾多斯應(yīng)用技術(shù)學院信息工程系，鄂爾多斯 017000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學機電工程學院，呼和浩特 010018；3.呼和浩特職業(yè)學院機電工程學院，呼和浩特 010051)

0 引言

植物葉片是植物進行光合作用的主要場所，其發(fā)育狀況直接影響植物的生長[1]。植物葉片卷曲度和厚度是反映植物抗旱性的重要指標[2-3]，深入研究這兩個參數(shù)對揭示植物的生長狀況、研究抗旱機制、選育耐旱植物以及實現(xiàn)環(huán)境控制具有重要的意義。

葉片幾何參數(shù)測量方法主要分為直接法和間接法。直接法通過破壞性取樣后進行測量，常見的有九宮格法、稱重法、求積儀法等[4-5]，該類方法主要依靠人工操作，測量精度低且費時費力，不能進行大規(guī)模數(shù)據(jù)測量；間接法主要利用相關(guān)儀器測定參數(shù)值[6]，該類方法設(shè)備價格昂貴、操作繁瑣、維修成本高[7]，且不適合大規(guī)模數(shù)據(jù)測量。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，近年來通過圖像處理方式分析和測量植物葉片幾何參數(shù)的方法備受關(guān)注[8-13]。此類方法在確保測量精度的前提下，提高了測量速度，且有助于批量測量。目前，多數(shù)學者研究的圖像測量方法僅針對平整型植物葉片進行測量，且針對葉面積的測量方法研究較多，而專門針對植物葉片厚度和卷曲度測量的研究卻鮮見報道。

本文以無芒隱子草葉片為研究對象，通過石蠟制片獲取無芒隱子草葉切片圖像，采用紅色灰度化方法結(jié)合閾值分割將目標和背景分離，在準確分割的基礎(chǔ)上，提出采用基于Graham算法的最小外接矩形法實現(xiàn)葉片卷曲度的測量，采用矢量積法和角點檢測相結(jié)合的凹凸點檢測算法實現(xiàn)葉片厚度的測量。

1 材料與方法

1.1 圖像采集

無芒隱子草葉片采集的試驗樣地在鄂爾多斯鄂托克旗境內(nèi)，東經(jīng)106°41′～108°54′，北緯38°18′～40°11′，平均海拔1 800 m，該地區(qū)氣候?qū)儆诘湫偷臏貛Т箨懶约撅L氣候，日照豐富，四季分明，無霜期短，降水少，全年較干旱。從試驗樣地中選取4個不同退化梯度樣地(對照區(qū)CK、輕度退化區(qū)LD、中度退化區(qū)MD和重度退化區(qū)HD)，樣區(qū)內(nèi)主要植被包括無芒隱子草(Cleistogenessongorica)、狹葉錦雞兒(Caraganastenophylla)、短花針茅(Stipabreviflora)、豬毛菜(Salsolacollina)、砂藍刺頭(Echinopsgmelini)等，草地平均高度為8 cm，蓋度僅為10%～25%。

于2016年7—8月，分別在4個退化梯度樣地隨機設(shè)立樣方40個，樣方尺寸為0.5 m×0.5 m，在樣方內(nèi)隨機選取同齡級、健康的無芒隱子草葉片30片，將其裝入標準固定液(Formalin-acetic acid-alcohol，F(xiàn)AA)，并置于4℃恒溫箱保存以備切片。

將無芒隱子草葉片從FAA標準固定液中取出，經(jīng)軟化、脫水、透明、浸蠟和包埋、切片、粘片和烘片、染色、封片等步驟完成石蠟制片[14]，獲得永久性玻片，利用生物光學顯微鏡(YYS-80E型)和配套的圖像采集系統(tǒng)CM1400型攝像機結(jié)合計算機，采集和存儲圖像。處理與分析圖像的計算機配置為Intel Core i5CPU M480@2.67 GHz，6 GB內(nèi)存，Windows 7操作系統(tǒng)，圖像處理軟件采用Matlab 2015a。

1.2 目標與背景分割算法

對試驗采集的圖像，首先提取圖像的R、G、B分量，根據(jù)圖像特征確定灰度化方法，然后設(shè)計矩形結(jié)構(gòu)元素，通過形態(tài)學開運算剔除粘連噪聲，接著設(shè)計濾波器掩模矩陣，進行線性濾波以消除鋸齒狀邊界，最后，采用最大類間方差(Otsu)方法自動選擇閾值進行二值處理，實現(xiàn)目標和背景的分割。

1.2.1灰度化

彩色圖像灰度化直接影響最終分割精度，常用的灰度化方法有分量法、最大值法、平均法和加權(quán)平均法。為了提高算法魯棒性，需要根據(jù)無芒隱子草葉片切片圖像的特點選取合適的灰度化方案。

本文隨機選取30幅測試圖像，R、G、B通道的均值分別為197.7、197.5、190.8。為了較好地實現(xiàn)目標與背景的分離，使用紅色特征灰度化方法，但圖像中含有較高藍色B分量，通過增大R、減小G和B[15]來調(diào)整三色權(quán)重，適合無芒隱子草葉片解剖圖像的灰度化方法為

Gray=2.8R-1.1G-1.4B

(1)

式中Gray——灰度

為定量評價本文灰度化方案的有效性，采用圖像信息熵(Entropy)、圖像平均梯度(Average gradient)和圖像對比度(Contrast)3個指標進行評價。

1.2.2形態(tài)學開運算

開運算處理可以斷開狹小間斷和消除細突出物，使對象輪廓變平滑。構(gòu)造大小為5×20的矩形結(jié)構(gòu)元素H，對灰度化圖像I進行開運算。

I°H=(I?H)⊕I

(2)

式中 ° ——開運算符號

?——腐蝕運算符號

⊕——膨脹運算符號

1.2.3線性濾波

線性濾波可以消除鋸齒狀邊緣，在M×N的圖像I上，用大小為m×n的濾波器掩模進行線性濾波，計算公式[16]為

(3)

其中

a=(m-1)/2b=(n-1)/2

式中g(shù)(x,y)——濾波輸出圖像

w(s,t)——空間濾波器

1.2.4最大類間方差

最大類間方差法是一種非參數(shù)化的全局閾值分割方法，是圖像分割中自動閾值選取的最佳算法[17-18]。

1.2.5分割質(zhì)量評價

為定量評價算法分割效果，本文在總結(jié)現(xiàn)有評價指標的基礎(chǔ)上，采用誤檢率[19](False positive rate，F(xiàn)PR)、漏檢率[20](False negative rate，F(xiàn)NR)和整體分割精度(Global segmentation accuracy，GSA)[21]作為評價指標，對算法有效性進行檢驗，所需的金基準分割圖通過Photoshop軟件手動分割獲得。FPR、FNR值越小，GSA值越大，分割精度越高。

1.3 目標參數(shù)測量

葉片卷曲度和厚度是葉片的重要參數(shù)指標，其定義如圖1所示，葉片卷曲度(LW)為葉片圖像中最遠兩點間的距離；葉片厚度(TL)為葉片上、下角質(zhì)層之間的距離，在實際測量中，葉片厚度為圖像左右邊界上凹點與凹點、凸點與凸點之間的距離。在1.2節(jié)圖像分割的基礎(chǔ)上，根據(jù)目標參數(shù)實際測量方式，采用圖像處理的方法實現(xiàn)葉片卷曲度和厚度的測量。

1.3.1葉片卷曲度測量

結(jié)合無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像輪廓的特點，采用8-鄰域邊界跟蹤算法[22]獲得圖像邊界上所有像素點，應(yīng)用Graham算法[23-24]構(gòu)造凸包，搜索葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像的最小外接矩形(Minimum bounding rectangle，MBR)，從而求出葉片卷曲度。算法的具體步驟為：

(1)采用8-鄰域邊界跟蹤算法提取圖像邊界，設(shè)邊界點坐標集為S。

(2)采用Graham算法構(gòu)造圖像輪廓凸包。①尋找S中距離y軸最近的點設(shè)為基點P0。②將S中其余點和基點P0構(gòu)成向量，并根據(jù)極角由小到大排序，記為P0,P1,…,Pn，如果有多個相同的極角點，只保留極徑最大的點。③將P0、P1、P2入棧。④對任意點Pi，如果棧頂?shù)?個點與其不構(gòu)成“左旋”關(guān)系，則將棧頂?shù)狞c出棧，直到?jīng)]有點出棧，再將當前點進棧。所有點處理完之后，最后棧中保存的點為目標圖像完整凸包。

(3)提取葉片最小外接矩形。①隨機選取凸包左右兩端點，設(shè)為A(x1,y1)、B(x2,y2)，構(gòu)成起始邊AB，以點A為中心旋轉(zhuǎn)角θ，使該邊平行于x坐標軸。②凸包上的所有點圍繞點A旋轉(zhuǎn)角θ。③以AB為上(下)邊界，找到y(tǒng)值最小(最大)的一個點，經(jīng)過此點作平行于x軸的直線，這就確定了下(上)邊界。然后找到x值最小和最大的左側(cè)點和右側(cè)點，經(jīng)過這兩個點分別做垂直于x軸的兩條直線，確定對應(yīng)的左右邊界。這樣即可得到一外接矩形，計算并保存邊AB、旋轉(zhuǎn)角θ，此時記錄外接矩形的頂點坐標和面積。④順序選擇下一條邊BC，若此邊已經(jīng)選擇，則順序執(zhí)行，否則跳轉(zhuǎn)至步驟①，比較所有外接矩形的面積，找出其中面積最小的外接矩形。⑤根據(jù)步驟③中的記錄，求出葉片的卷曲度。

1.3.2葉片厚度測量

本文在提取葉片外邊界的基礎(chǔ)上，應(yīng)用改進的凹、凸點檢測算法提取圖像外邊界的凹點和凸點，最后進行凹點與凹點匹配、凸點與凸點匹配，應(yīng)用歐幾里得距離計算出葉片厚度。

傳統(tǒng)矢量積法檢測出大量與實際測量不相符的無用點，給后續(xù)準確匹配凹凸點帶來不便，為獲得較為準確的、符合實際測量點的凹點和凸點，本文提出將角點檢測和矢量積法相結(jié)合的凹凸點檢測算法，算法首先采用最小周長多邊形近似法獲取輪廓頂點，應(yīng)用自適應(yīng)閾值和支持動態(tài)區(qū)域的曲率尺度空間角點檢測算法[21]預選出候選的凹凸點，結(jié)合矢量積法檢測出頂點的凹凸性，剔除角點中非凹、凸點，剩余角點即為有用的凹凸點。算法具體步驟為：①求無芒隱子草葉片解剖結(jié)果圖像的最小外接矩形，并對其進行旋轉(zhuǎn)，使得長軸平行于y坐標軸。②獲取無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像最小周長近似多邊形和頂點集合Pv(v=1,2,3,…)。③根據(jù)矢量積法獲取凹點集Pa和凸點集Pt。④填充步驟①中獲得的無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像的邊緣輪廓斷裂點，找到T形角點。⑤計算輪廓上每個點的曲率。⑥將局部曲率最大值點設(shè)為候選角點，并根據(jù)自適應(yīng)閾值剔除圓角點，同時剔除因噪聲和細節(jié)產(chǎn)生的偽角點，閾值設(shè)定和偽角點判斷準則見文獻[25]。⑦在較低尺度下對已確定的角點定位。⑧比較T形角點與提取出角點的距離，剔除兩個相隔較近的其中一個角點，得到最終正確的角點集C。⑨將C設(shè)為候選凹凸點集，分別與Pa和Pt中的點進行距離對比，從而將C中的點分為凹點集C1和凸點集C2。⑩對C1和C2中的點分別按照y坐標的升序排序。以y坐標值最大點為分界點，將C1和C2分別分為左右集合：凹點左集合(C1l)、凹點右集合(C1r)、凸點左集合(C2l)、凸點右集合(C2r)。將C1l與C1r中的點根據(jù)距離進行凹點匹配，并求出匹配點之間的歐氏距離，同樣，將C2l和C2r中的點根據(jù)距離進行凸點匹配，并求出匹配點的歐氏距離，進而求出葉片厚度。

2 試驗與結(jié)果分析

2.1 灰度化處理

對任意選取的30幅無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像進行試驗，圖2為分別采用不同方法處理后的效果圖，由圖2可知，采用本文方法處理后，能夠明確區(qū)分維管束、泡狀細胞、葉肉組織等解剖結(jié)構(gòu)，圖像對比度明顯提升。

表1給出了任意選取的30幅圖像經(jīng)本文方法處理后的圖像信息熵、平均梯度、對比度，并與分量法、最大值法、平均法、加權(quán)平均法進行對比，結(jié)果顯示，采用本文方法處理后，圖像的各項指標均明顯高于其余4種方法處理后的結(jié)果。

表1 不同灰度化方法處理效果評價

圖3為應(yīng)用不同灰度化方法對無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像灰度化后，經(jīng)形態(tài)學開運算、線性濾波和閾值分割后的分割結(jié)果對比圖，由圖3可知，本文提出的方法使目標分割結(jié)果更為完整、準確。

2.2 目標和背景分割試驗

圖像灰度化處理后，經(jīng)形態(tài)學開運算、線性濾波、閾值分割，獲得最終分割結(jié)果，如圖4所示。試驗提取了參照圖目標邊界(圖4e)，并將提取的邊界疊加于分割結(jié)果圖(圖4f)，結(jié)果顯示，分割后的目標區(qū)域與目標原邊界基本吻合。

表2給出了30幅圖像試驗的平均誤檢率、平均漏檢率和整體分割精度。由表2可知，平均誤檢率為0.75%，平均漏檢率為3.49%，整體分割精度達到98.14%。結(jié)果表明本文算法能夠?qū)崿F(xiàn)目標和背景的精確分割，滿足后續(xù)特征參數(shù)測量需求。

表2 分割效果評價結(jié)果

2.3 目標參數(shù)測量試驗

2.3.1葉片卷曲度測量

圖5為目標卷曲度測量試驗示例，由圖5可知，對于任意朝向的無芒隱子草葉片圖像均可以求得其最小外接矩形，最小外接矩形長度與無芒隱子草葉片卷曲度的實際測量方式結(jié)果相符。

表3為本文方法測量值與顯微鏡自帶軟件ToupTek Toupview交互式多次測量均值對比，由表3可知，本文方法測量值與交互式測量均值平均相對誤差為0.96%，速度提高了約10倍，結(jié)果表明本文方法可以準確測量無芒隱子草葉片卷曲度。

表3 葉片卷曲度測量值與交互式測量值比較

2.3.2葉片厚度測量

試驗過程示例如圖6所示，結(jié)果顯示，傳統(tǒng)的矢量積法檢測出較多與實際測量不相符的凹凸點(圖6d)，本文方法剔除了許多無用點(圖6e)，最終實現(xiàn)的凹點與凹點、凸點與凸點之間的連線與實際測量方式相符。

表4給出了30幅測試圖像應(yīng)用本文方法測量與應(yīng)用顯微鏡自帶軟件ToupTek Toupview交互式測量均值對比，由表4可知，通過本文方法測量的平均相對誤差僅為3.69%，速度提高了約37倍，說明本文方法可以較為準確地測量無芒隱子草葉片厚度，且極大地提高了效率。

表4 葉片厚度測量值與交互式測量值比較

3 結(jié)論

(1)提出了適合無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像的紅色灰度化方案，并與分量法、最大值法、平均法、加權(quán)平均法進行對比，結(jié)果表明，本文方法優(yōu)于其他4種方法。使用最大類間方差結(jié)合形態(tài)學開運算和線性濾波，實現(xiàn)了無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)圖像目標和背景的準確分割，30幅圖像分割的平均誤檢率為0.75%，平均漏檢率為3.49%，平均整體分割精度達到了98.14%。

(2)提出了采用Graham算法構(gòu)造凸包的最小外接矩形法，實現(xiàn)了葉片卷曲度的準確測量。將測量值與交互式測量均值進行了對比，30幅測試圖像的平均相對誤差為0.96%，速度提高了約10倍。

(3)提出了角點檢測和矢量積法相結(jié)合的凹凸點檢測算法，結(jié)合凹點匹配和凸點匹配實現(xiàn)了葉片厚度的準確測量，將測量值與交互式測量均值進行了對比，30幅測試圖像的平均相對誤差為3.69%，速度提高了約37倍。

(4)本文通過圖像處理手段實現(xiàn)了無芒隱子草葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的提取和測量，克服了人工交互測量效率低、實現(xiàn)性差的缺點。