基于19F化學標記磷酸化泛素的溫度傳感器開發(fā)

張志武，楊 菊，聶澤鋒，葉尚祥，董 旭，唐 淳

1. 中國科學院生物磁共振分析重點實驗室，波譜與原子分子物理國家重點實驗室（中國科學院 精密測量科學與技術創(chuàng)新研究院），湖北 武漢 430071；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 華中科技大學武漢光電國家研究中心，湖北 武漢 430074；4. 北京分子科學國家研究中心，北京大學 化學與分子工程學院，北京大學，北京 100871

引 言

溫度是所有生命活動的關鍵調控因素之一，它能夠影響基因表達、蛋白質結構、蛋白質之間相互作用等[1-5].因此，準確測定生物體內外的溫度，對于生物分子化學特性和功能的研究具有重要的意義.細胞作為生命有機體的基礎，由多個不同功能的單元組成，而正因為不同單元的功能各異，因此細胞中不同區(qū)域的溫度也存在差異[2,3,6].例如，全身性炎癥通常伴有體溫變化，表現(xiàn)為發(fā)燒或體溫過低.這種體溫變化會直接影響細胞內生物分子的活性[7,8].ATP在線粒體內通過氧化還原呼吸鏈生成，而在此過程中產生的能量約有1/3以熱量方式消耗，因此線粒體的內部溫度能夠超過50 ℃[9-11].目前，主流的分子溫度傳感器的開發(fā)主要依托于溫度敏感的熒光蛋白質和人工化合物，通過光學檢測來反推溫度[12,13].而在基于核磁共振（NMR）檢測的溫度傳感器方面，主要以RNA為檢測對象來進行溫度測定[14].由此可見，分子溫度傳感器還存在較大的發(fā)展空間，而開發(fā)能夠精確檢測生物樣品內外溫度的傳感器有助于加深對細胞功能本質的認識.

泛素（Ub）是一種廣泛存在于真核細胞內的信號蛋白，它由5段β-片層與1段α-螺旋組成，具有穩(wěn)定的三級結構[15,16].Ser65被激酶PINK1磷酸化之后的泛素（pUb），在溶液中呈現(xiàn)兩個慢交換的穩(wěn)定構象—伸展態(tài)和收縮態(tài)[17-22].舒展態(tài)pUb與未磷酸化Ub具有高度相似的空間結構.與舒展態(tài)pUb相比，收縮態(tài)pUb碳端的β-片層向氮端收縮了兩個氨基酸.更重要的是，除了構象數(shù)目和結構的變化以外，Ser65磷酸化還增強了泛素對溶液pH的敏感性，因此pUb的兩種構象比例會隨著溶液pH變化而變化[17,19,21].而我們進一步發(fā)現(xiàn)pUb兩種構象的比例還受到溫度的調控，該特性能夠被用于溫度傳感器的開發(fā).基于pUb對溫度的敏感性，我們開發(fā)了一套19F化學標記pUb的溫度傳感器，利用19F NMR檢測系統(tǒng)中pUb兩種構象的比例，能夠快速精確地測定生物樣品的溫度.該系統(tǒng)不僅能夠用于檢測生物樣品的體外溫度，還有望延伸用于檢測細胞內的溫度.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced）購自廣州賽國生物科技有限公司；D-glucose、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、葡萄糖購自國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉（Yeast extract）、胰蛋白胨（Tryptone）購自Oxoid公司；二硫蘇糖醇（DTT）購自北京博奧拓達科技有限公司；腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽水合物（ATP·Na2·xH2O，配置為ATP母液）、二甲基亞砜（DMSO）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；15N標記的氯化銨（15NH4Cl）購自Sigma-Aldrich；3-溴-1,1,1-三氟丙酮（BFA）購自北京百靈威科技有限公司.

1.2 質粒構建、蛋白表達和純化

將人源Ub克隆到pET11a載體，然后采用QuikChange方法[23]分別引入D32C、K48C和Q62C突變（分別命名為D32C Ub、K48C Ub和Q62C Ub），大腸桿菌（BL21 star）細胞用于蛋白質表達，首先將質粒轉化至大腸桿菌（BL21 star）感受態(tài)細胞中，并采用稀釋涂布平板法涂布于細胞培養(yǎng)板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的10 mL Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)，然后擴大到1 L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待吸光光度值OD600=0.6~0.9時，加入0.5 mmol/L IPTG于37 ℃誘導表達5 h.表達穩(wěn)定同位素標記的野生型Ub蛋白（15N-Ub）時，使用15NH4Cl和D-glucose作為大腸桿菌生長的唯一氮源和碳源，并以M9培養(yǎng)基取代LB培養(yǎng)基.表達完成后收取菌液，使用Beckman離心機離心（5 000 rpm）10 min，收集沉淀.然后采用高壓勻質儀高壓破碎重懸的菌液（20 mmol/L醋酸鈉，2 mmol/L DTT，pH 5.0），高速離心（20 000 rpm）20 min后取上清，先后采用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂（GE Healthcare）和Sephacryl S100色譜柱（GE Healthcare）純化即可得到純化后的蛋白，液氮速凍后存于-80 ℃.

將磷酸化激酶PINK1克隆到pGEX-4T-1載體.大腸桿菌（BL21 star）細胞用于蛋白質表達，采用200 μmol/L IPTG在20 ℃下誘導表達16 h.PINK1蛋白的N端融合有GST（Glutathione S-transferase）標簽，故采用Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare）初步純化，然后再經過Sephacryl S100色譜柱（GE Healthcare）純化即可.PINK1蛋白的整個純化過程都在低溫條件下進行，以保證酶的活性.

1.3 磷酸化蛋白的制備

將PINK1、15N-Ub（或D32C Ub、K48C Ub、Q62C Ub）、MgCl2和ATP以1:100:5 000:5 000的摩爾比在20 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L DTT）中混合，于25 ℃水浴反應12 h.然后使用Source Q柱（GE Healthcare）純化產物（磷酸化之后的蛋白質樣品），并使用ESI-Q-TOF-MS（Agilent6530）測定精確分子量來確認.

1.4 19F化學標記蛋白制備

配置含有5 mol/L BFA的DMSO溶液.通過脫鹽（Hi-Prep 26/10 Desalting柱，GE Healthcare）除去pUb半胱氨酸突變體緩沖液中（20 mmol/L醋酸鈉，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，pH 5.0）的DTT.然后在20 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）中以1:10的摩爾比混合泛素和探針，在室溫25 ℃條件下反應2 h.然后使用脫鹽（HiPrep 26/10脫鹽柱，GE Healthcare）從反應混合物中純化產物（19F標記的蛋白質），并利用電噴霧-四極桿-飛行時間質譜儀（ESI-Q-TOF-MS，Agilent6530）測定精確分子量來確認.

1.5 NMR實驗和數(shù)據處理

將所有用于NMR實驗的蛋白樣品（15N-pUb、19F-D32C pUb、19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb）溶于20 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4，含150 mmol/L NaCl，5% D2O）.

1H-15N HSQC實驗在配備了低溫探頭的Bruker 600型NMR譜儀上進行.譜寬直接維F2為16 ppm，間接維F1為 25 ppm，采樣點數(shù)為t2×t1=2 048×256，1H-15N HSQC 數(shù)據采用 NMRPipe（version 2010.160.15.01）和CcpNmr（version 2.4.2）處理.

19F NMR實驗均在配備了多通道低溫探頭的Bruker 600型NMR譜儀上進行，通過溫度控制單元控制溫度梯度.19F共振頻率為564.39 MHz，譜寬為10 ppm，采樣點數(shù)為8 k.pUb的19F NMR譜圖中有兩個峰，分別對應于兩個構象狀態(tài)——松弛狀態(tài)和收縮狀態(tài).通過Bruker TopSpin 3.6.1對19F NMR的譜峰面積進行積分.

測定19F核的T1采用的脈沖序列為t1ir，采樣次數(shù)為8，采樣點數(shù)為64 k，譜寬為20 ppm；測定T2采用的脈沖序列為cpmg，采樣次數(shù)為8，采樣點數(shù)為64 k，譜寬為20 ppm，其中D20為0.000 16 s.數(shù)據處理均在Bruker TopSpin 3.6.1上完成.

2 結果與討論

2.1 pUb的兩種構象比例隨溫度的變化

我們首先采集了不同溫度下的15N-pUb的1H-15N HSQC譜圖.在10 ℃和25 ℃時，其HSQC譜圖[圖1(a)和1(b)]中的信號峰均超過120個，通過與已知文獻[22]進行比對，將這些信號分別歸屬pUb的舒展態(tài)和收縮態(tài).但值得注意的是，不同溫度下兩種構象的信號強度發(fā)生了變化：隨著溫度升高，收縮態(tài)比例升高，舒展態(tài)比例降低.這個現(xiàn)象說明pUb兩種構象比例受到溫度調控.1H-15N HSQC譜中氨基酸信號的譜峰強度與蛋白質局部的弛豫特征息息相關，因此，當使用信號面積進行定量分析時往往會引入較大誤差.為了準確定量，需要優(yōu)化實驗條件.

圖1 15N-pUb樣品在(a) 10 ℃和(b) 25℃溫度下的1H-15N HSQC譜圖：當溫度升高，舒展態(tài)（縮寫為rl）的信號強度降低，收縮態(tài)（縮寫為rt）的信號強度升高Fig. 1 1H-15N HSQC spectra of 15N-pUb sample at (a) 10 ℃ and (b) 25 ℃: When the temperature increases, the signal intensity of the relaxed state (rl) decreases, while the signal intensity of the retracted state (rt) increases

2.2 19F化學標記對泛素結構的影響

19F核的旋磁比與1H核相近，并且不存在于天然的生物大分子中，因此，利用19F NMR檢測19F化學標記的蛋白質，能夠采集到信噪比和分辨率均較高的19F NMR譜圖，并用于分析目標分子的結構特征[24-27].為了完成19F的定點標記，我們選取pUb的D32、K48和Q62位點分別進行半胱氨酸突變，用于連接BFA探針[26][圖2(a)和2(b)].質譜結果顯示pUb連接BFA探針后，19F-K48C pUb分子量為8 747.46 [圖2(c)]，與理論分子量加上一個水分子（8 729.86+18.02）一致，表明19F探針成功連接于指定位點.通過比較BFA連接前后的pUb的1H NMR譜圖，可以發(fā)現(xiàn)19F化學標記未影響pUb譜圖的輪廓[圖2(d)]，說明連接BFA探針的pUb保持了天然形態(tài)的二級結構和三級結構.由此可以推斷，連接了BFA探針沒有改變pUb的二級和三級結構，連接BFA探針后的pUb的伸展態(tài)和收縮態(tài)的構象比例仍然受到溫度的調控.

2.3 19F化學標記位點的優(yōu)化

圖2 (a) pUb 舒展態(tài)和收縮態(tài)的示意圖，用于連接BFA探針的半胱氨酸突變位點（D32C、K48C、Q62C）使用球棍模型顯示，每次實驗只突變其中一個；(b) BFA探針連接pUb突變體的示意圖，BFA通過取代反應連接于pUb表面的半胱氨酸突變位點；(c)利用高分辨質譜測得的19F-K48C pUb的分子量為8 747.46，與理論分子量與一個水分子的分子量之和一致；(d) 19F化學標記K48C pUb前后的氨基氫的1H NMR譜，反應前后其輪廓未發(fā)生明顯變化（25 ℃）Fig. 2 (a) pUbs in the relaxed state and retracted state are shown. The cysteine mutation sites (D32C, K48C, Q62C) for attachment of the BFA probe are displayed as ball and stick model, one mutation at each time; (b) Scheme of BFA reaction with pUb, BFA is connected to the cysteine mutation site on the surface of pUb through substitution reaction; (c) Mass spectrometry is used to confirm the reaction between BFA probe and K48C pUb, the result showed that the molecular weight of the protein after the reaction was 8 747.46, which was consistent with the sum of the theoretical molecular weight plus a water molecule; (d) The amino regions of 1H NMR spectra of K48C pUb before and after 19F chemical labeling, indicating no obvious change of the spectrum profile (25 ℃)

圖3 (a) 19F-D32C pUb、(b) 19F-K48C pUb和(c) 19F-Q62C pUb在25 ℃條件下的19F NMR譜圖Fig. 3 19F NMR spectra of (a) 19F-D32C pUb, (b) 19F-K48C pUb and (c) 19F-Q62C pUb at 25 ℃

我們分別對連接了BFA探針的pUb突變體，包括19F-D32C pUb、19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb進行了19F NMR實驗.一維19F NMR譜圖顯示19F-D32C pUb的信號為重疊的雙峰[圖3(a)]，說明利用19F NMR能夠捕獲到pUb的兩種構象，但是不同構象的信號高度重疊，這可能與19F標記位點距離磷酸化位點較遠有關.重疊的NMR信號為快速準確地定量分析帶來嚴重干擾.與19F-D32C pUb相比，19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb的信號均為兩個高分辨率的單峰[圖3(b)和3(c)].通過積分，獲得19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb中兩種構象的比例（舒展態(tài):收縮態(tài)）分別約為 50%:50%和60%:40%.19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb之間構象比例的差別可能與標記位點有關：Q62C距離磷酸化位點較近，19F探針可能與磷酸根相互作用，進而影響了其NMR特征，最終造成峰強上的區(qū)別.已發(fā)表文獻[19,21,22]指出在與本文相同溶液條件下pUb兩種狀態(tài)的比例約為5:5，因此19F-K48C pUb更能真實的反映出溶液中pUb構象的比例，因此在接下來的研究中我們以19F-K48C pUb為模型開發(fā)了溫度傳感器.本文還測定了19F-K48C pUb中舒展態(tài)T1為（327.73±1.35）ms，T2為（56.64±1.12）ms；收縮態(tài)T1為（331.61±2.18）ms，T2為（40.81±3.18）ms（圖 4，實驗溫度為 25 ℃）.

圖4 (a) 19F-K48C pUb舒展態(tài)T1擬合；(b) 19F-K48C pUb收縮態(tài)T1擬合；(c) 19F-K48C pUb舒展態(tài)T2擬合；(d) 19F-K48C pUb收縮態(tài)T2擬合Fig. 4 (a) T1 fit for relaxed state of 19F-K48C pUb; (b) T1 fit for retracted state of 19F-K48C pUb; (c) T2 fit for relaxed state of 19F-K48C pUb; (d) T2 fit for retraced state of 19F-K48C pUb

2.4 19F-K48C pUb兩種構象的比例隨溫度變化的19F NMR檢測

我們利用19F NMR實驗檢測了不同溫度下19F-K48C pUb兩種構象的比例.隨著溫度降低，低場區(qū)的信號強度逐漸升高[圖5(a)].該構象轉換的現(xiàn)象與圖 1中所觀察到的現(xiàn)象一致，同時說明低場區(qū)的信號來自于舒展態(tài)，高場區(qū)的信號則來自于收縮態(tài).通過對溫度梯度下不同信號的面積進行積分[圖5(b)]，得知收縮態(tài)的構象比例在5 ℃到35 ℃溫度區(qū)間由~40%上升至~60%，而舒展態(tài)的構象比例則呈現(xiàn)出相應的下降趨勢.在變溫實驗中，我們使用的pH 7.4的HEPES緩沖液.HEPES的pKa與溫度的關系（ΔpKa/℃）為-0.014[28]，因此當溫度從5 ℃升高至35 ℃時，HEPES緩沖液的pH將從~7.7降至~7.3.已發(fā)表的文獻指出降低pH能夠增加舒展態(tài)比例，而升高pH則能夠增加收縮態(tài)比例[21].但是本文結果顯示：溫度升高（pH降低）時，收縮態(tài)的比例上升；而溫度降低（pH升高）時，舒展態(tài)比例上升.這種趨勢與上述文獻報道的相反，說明本研究中溫度梯度中，19F-K48C pUb兩種構象的比例變化反映的是溫度的影響.

圖5 (a)不同溫度下19F-K48C pUb的19F NMR譜圖；(b)兩種構象的比例變化和溫度梯度之間呈線性Fig. 5 (a) The 19F NMR spectra of 19F-K48C pUb at different temperature; (b) The linear relationship between the ratio change of the two conformations and the temperature gradient

通過對溫度和構象比例進行擬合，我們發(fā)現(xiàn)pUb構象比例變化與溫度梯度之間為線性關系，測定pUb構象比例之后可以根據相關方程（收縮態(tài)：y=0.007x+0.342 6；舒展態(tài)y=-0.007x+0.657 4.y為構象比例，x為溫度）計算對應的溫度.從熱力學平衡的角度來看，從舒展態(tài)轉化到收縮態(tài)應該是一個吸熱的一元反應，因此平衡常數(shù)隨著溫度的變化而變化.

我們進一步對該方程進行了驗證，測定了293.15 K下19F-K48C pUb的19F NMR譜圖（圖6），由圖中積分面積可計算出，此時收縮態(tài)比例為0.482 1，舒展態(tài)比例為0.517 8，分別代入舒展態(tài)和收縮態(tài)線性方程，計算得出此時溫度為19.93 ℃（293.08 K），與理論值的誤差為0.07 ℃，說明該溫度傳感器在其可觀測范圍內準確性較高.

圖6 293.15 K下19F-K48C pUb的19F NMR譜Fig. 6 19F NMR spectrum of 19F-K48C pUb at 293.15 K

細胞內NMR作為目前為數(shù)不多的蛋白質原位檢測手段，能夠檢測反應生物分子在天然環(huán)境中的結構特征，而蛋白質結構特征與其所處環(huán)境溫度息息相關.目前已發(fā)表的利用NMR檢測的溫度傳感器主要依托于RNA二級結構對特定溫度的敏感性，但只能提供有限的溫度量程.而pUb具有較好的耐熱性，它的空間結構的熔點約為70 ℃[22]，因此能夠用于檢測較大范圍的溫度變化.而且采用19F NMR檢測19F-pUb構象比例的變化，并利用構象比例的變化與溫度之間的關系（溫度每升高1 ℃，舒展態(tài)或者收縮態(tài)的比例將會下降或者升高~0.7%）可以直接反饋樣品溫度的變化，因此可作為一種基于NMR檢測的溫度傳感器.并且這種溫度傳感器不僅僅可以用于體外實驗，還有望延伸至細胞內的溫敏檢測，例如將19F-pUb轉移至細胞內部，利用原位NMR檢測技術，實時監(jiān)測細胞內部溫度，助力揭示蛋白質結構與功能的關系.

3 結論

本研究首先發(fā)現(xiàn)pUb的兩種構象比例受到溫度影響而變化.基于該特征，本文開發(fā)了一套基于NMR檢測的溫度傳感器.我們對pUb進行了19F化學標記，并利用19F NMR技術表征了不同溫度下pUb兩種構象的比例，建立了構象比例變化與溫度之間的關系，利用這一關系能夠很好的檢測溫度的變化.這溫度傳感器不僅可適用于基于NMR的體外溫度檢測，而且有望用于細胞內溫度檢測.

致謝

感謝國家重點研發(fā)計劃的支持（2017YFA0505400，2018YFA0507700）

利益沖突

無