核磁共振技術(shù)在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

陳曉麗，呂 微，蘇秋成，付 娟，莫家媚，劉琪英*

1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640；2. 中國科學(xué)院可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640；3. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點實驗室，廣東 廣州 510640

引 言

隨著化石資源消耗引發(fā)的能源危機和環(huán)境問題的日益加劇，生物質(zhì)作為重要的可再生資源，可以通過物理、化學(xué)或生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化為小分子化合物，因此被認(rèn)為是生產(chǎn)高品質(zhì)化學(xué)品和燃料的重要碳源.生物質(zhì)主要組分包括纖維素（35%~50%）、半纖維素（20%~30%）和木質(zhì)素（15%~30%）[1]，是世界上儲量最為豐富的資源.其中，纖維素是由葡萄糖單元通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線狀聚合物，同一鏈中不同葡萄糖分子之間以及相鄰鏈之間又通過氫鍵聯(lián)在一起組成；半纖維素是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，單糖聚合體間分別以共價鍵、氫鍵、醚鍵和酯鍵鏈接；木質(zhì)素由愈創(chuàng)木基丙烷（G）、紫丁香基丙烷（S）和對羥苯基丙烷（H）結(jié)構(gòu)單元通過各種醚鍵（C-O-C）和C-C鍵聚合而成的三維網(wǎng)狀無定型結(jié)構(gòu)聚合物[2].生物質(zhì)各個組分間以化學(xué)鍵和共價鍵相互交聯(lián)的方式鍵合成具有三維立體結(jié)構(gòu)的天然高分子聚合物，具有一定的抗解聚性，從而使得生物質(zhì)的解聚難度增加、過程變得復(fù)雜.選擇性解聚切斷生物質(zhì)結(jié)構(gòu)中C-O和C-C鍵，可以得到包含芳香基、酚羥基、羰基、甲氧基等小分子化合物，如乙醇、乙二醇、丙二醇等重要的中間體、食品添加劑和液體燃料等，而且這些小分子化合物在生產(chǎn)高品質(zhì)化學(xué)品和燃料方面具有極大的應(yīng)用前景[3].

生物質(zhì)有效解聚是其轉(zhuǎn)化利用過程中的關(guān)鍵，而高效解聚技術(shù)的獲取源于對生物質(zhì)解聚路徑及結(jié)構(gòu)演變規(guī)律的深入認(rèn)識和掌握[4].對生物質(zhì)解聚規(guī)律的認(rèn)識必須借助現(xiàn)有的多種分析手段和技術(shù).目前，越來越多的表征技術(shù)開始應(yīng)用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究，例如：通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、氣相色譜（GC）和高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)對可揮發(fā)解聚產(chǎn)物進行定性和定量分析，可直觀有效地判斷生物質(zhì)的解聚轉(zhuǎn)化效率；通過凝膠滲透色譜（GPC）技術(shù)分析生物質(zhì)解聚后的碎片分子量分布信息，可掌握三組分在解聚體系中結(jié)構(gòu)的拆解情況；通過裂解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（Py-GC/MS）技術(shù)分析木質(zhì)素高溫裂解產(chǎn)物及其選擇性分布情況（如可揮發(fā)性小分子產(chǎn)物的類型和含量等），可輔助探究木質(zhì)素的高溫裂解路徑[5]；通過X射線光電子能譜（XPS）分析獲取生物質(zhì)中處于不同化學(xué)環(huán)境的碳原子和氧原子的化學(xué)價態(tài)和結(jié)合能等信息，有助于推斷解聚過程中生物質(zhì)C-O、C-C鍵的斷裂情況及變化規(guī)律[6]；通過傅立葉紅外光譜（FT-IR）和紫外-可見-近紅外吸收光譜（UV-Vis-NIR）分析原料、產(chǎn)物和殘渣表面分子的化學(xué)鍵和官能團特征吸收峰可獲得生物質(zhì)解聚過程中化學(xué)鍵的變化信息，推測解聚過程和結(jié)構(gòu)演變趨勢[7,8].通過核磁共振（NMR）波譜（包括1H NMR、13C NMR、31P NMR及多維相關(guān)譜）可獲得有關(guān)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、官能團和鏈接鍵等信息，幫助推導(dǎo)大分子單元間鏈接鍵的類型、斷裂情況，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征及轉(zhuǎn)化路徑[9].這些表征技術(shù)的應(yīng)用加深了科研人員對生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)鍵合方式和斷裂途徑的認(rèn)知.相比其他分析表征技術(shù)，NMR技術(shù)可以精確的反映原子核所處化學(xué)環(huán)境的細(xì)微變化，提供有關(guān)組分的分子結(jié)構(gòu)（包括化學(xué)位移、積分面積、耦合裂分等等）和動力學(xué)等信息，在復(fù)雜化合物尤其是天然高分子化合物的結(jié)構(gòu)解析方面具有顯著優(yōu)勢，是天然大分子鏈接鍵斷裂、拆解過程及結(jié)構(gòu)演變分析必不可少的工具.此外，NMR技術(shù)還具有操作簡便快速、可重復(fù)性強、測量準(zhǔn)確、能夠保持樣品完整性等優(yōu)點.NMR尤其是液體NMR技術(shù)目前已成為生物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中極為關(guān)鍵的表征手段.

本文首先簡要介紹了NMR技術(shù)的原理，再分別從1H NMR、13C NMR、31P NMR和2D HSQC四個方面論述其在生物質(zhì)結(jié)構(gòu)表征、催化解聚機理、反應(yīng)路徑探究和產(chǎn)物定量分析中的應(yīng)用，討論了其中存在的主要問題，并對相關(guān)技術(shù)的發(fā)展進行了展望.

1 NMR技術(shù)

自旋量子數(shù)I≠0的原子核都會有核自旋產(chǎn)生.原子核由帶正電荷的質(zhì)子和不帶電荷的中子組成，帶電原子核的自旋運動會產(chǎn)生微觀磁矩.在磁場中，自旋能級發(fā)生分裂，受到與該能級間隔相匹配的射頻照射時，原子核會吸收射頻輻射的能量，產(chǎn)生能級躍遷，即發(fā)生NMR吸收[10].相鄰能級的能量差（ΔE）與外加磁場強度（H0）呈正比，也與核的旋磁比（γ）相關(guān)，基本關(guān)系如(1)式所示，其中h為普朗克常數(shù).

NMR技術(shù)近年來發(fā)展迅速，包括一維、二維在內(nèi)的多種NMR技術(shù)方法得以開發(fā)，定量分析也已不再局限于一維NMR，異核乃至二維等NMR的定量分析也得以報道.采用的NMR技術(shù)不同，樣品制備和參數(shù)設(shè)置也有所差異.例如：固體1H NMR實驗要求樣品為固體粉末，且顆粒細(xì)密均勻，生物質(zhì)樣品量一般在20~100 mg以上，樣品的延遲時間（D1）相對較大，一般設(shè)置為7 s，掃描次數(shù)通常需要達到128次；而對于液體1H NMR實驗，一般情況下，樣品須溶于氘代試劑，并制備成均一溶液，對樣品需求量較少，一般將3~10 mg生物質(zhì)樣品溶解于0.5 mL氘代試劑中，D1通常設(shè)置為1.5 s，掃描4~6次，就可得到信噪比較高的信號.氘代溶劑在液體NMR測試中不可或缺，目前市場上銷售的氘代試劑種類有很多種，可以作為生物質(zhì)溶劑的氘代試劑有十余種，包括氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（CH3OD）、氘代水（D2O）、氘代丙酮[(CD3)2CO]和氘代二甲亞砜[(CD3)2SO]等.

雖然有關(guān)生物質(zhì)的NMR分析已發(fā)表了大量的文獻[11-12]，NMR技術(shù)已成為生物質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化分析的常規(guī)方法，但是NMR技術(shù)并不能檢測所有的原子核.NMR常用的同位素核包括1H、11B、13C、15N、17O、19F、29Si、31P等.其中，1H核和31P核的天然豐度接近100%，靈敏度較高，往往較短時間內(nèi)就可以得到信噪比很高的NMR信號；13C核天然豐度為1.1%左右，通過增加掃描次數(shù)，也可以得到信噪比較高的信號，且信號分布范圍較寬.而且在生物質(zhì)中，這幾種元素含量豐富，故1H NMR、13C NMR和31P NMR在生物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用最為廣泛.在生物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用最多的二維NMR技術(shù)是異核單量子相關(guān)譜（2D HSQC）.

2 NMR技術(shù)在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

2.1 1H NMR

多糖（polysaccharide）是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，在自然界分布極廣，是生物質(zhì)的主要成分之一.1H NMR可以非常有效地識別多糖解聚產(chǎn)物中糖苷鍵的類型及其數(shù)量和比例，以及聚合物中不同鍵的鏈接結(jié)構(gòu)和位置.Cheng等[12]歸納了NMR技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)多糖的化學(xué)位移與組成糖單元的化學(xué)位移之間存在良好的相關(guān)性.如多糖的H-2至H-6的信號位于δH3.5~4.5，H-1位于δH4.5~5.8；對于單糖，α-異構(gòu)體H-1（具有赤道H）特征峰位于δH5.3~5.8，β-異構(gòu)體（具有軸向H）位于δH4.5~4.8.纖維素是葡萄糖單元通過β-糖苷鍵鏈接成的聚合體，解聚產(chǎn)物為β-D-吡喃葡萄糖，該產(chǎn)物C-1、C-3和C-2位置上的質(zhì)子特征峰分別為δH3.74、3.24和3.03.通過建立多糖和單糖的NMR信息數(shù)據(jù)庫，可以幫助快速鑒別單糖和多糖的類型及結(jié)構(gòu).

1H NMR應(yīng)用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究時，主要用于生物質(zhì)及其衍生物的結(jié)構(gòu)分析、催化轉(zhuǎn)化過程及反應(yīng)機理的研究.廣州能源研究所呂微等[13]借助1H NMR分析了不同溶劑條件下木質(zhì)素水解產(chǎn)物的特征，通過1H NMR圖譜中位于δH4.1~4.6的β-O-4指紋區(qū)信號強度差異，清晰說明了單雙相溶劑體系對木質(zhì)素鏈接鍵β-O-4斷裂及解聚效果的影響；同時，在δH4.1~4.6處豐富的指紋信號表明在含有乙醇的溶劑體系中，特別是在乙酸乙酯/水（EtOAc/H2O）體系中，有更多的烷基芳烴和酯化產(chǎn)物生成.Zhang等[14]研究了離子液體中制備的木聚糖接枝聚己內(nèi)酯共聚物，在共聚物的1H NMR譜中，發(fā)現(xiàn)位于δH3.02、3.13、3.25、3.49、3.85和4.26的信號分別對應(yīng)木聚糖骨架上的H-2、H-5a、H-3、H-4、H-5e和H-1，位于δH2.25、1.52、1.41、1.30、3.45和3.98的信號對應(yīng)聚己內(nèi)酯側(cè)鏈中的亞甲基質(zhì)子，來自亞甲基上e′位置的羥基（e′-OH）質(zhì)子信號為δH4.39；譜圖中沒有來自羧酸的質(zhì)子信號，這說明聚己內(nèi)酯附著在木聚糖上并接枝形成酯共聚物.在纖維素的解聚方面，Tan等[15]利用1H NMR對Al2(SO4)3/乙醇-水體系催化木薯解聚過程進行表征，發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖中H-1和H-2的特征峰（δH5.15、δH3.12）強度明顯變?nèi)?，表明Al2(SO4)3在乙醇-水體系發(fā)生水解形成Lewis酸，Lewis酸可催化葡萄糖發(fā)生C-2→C-1的氫轉(zhuǎn)移，異構(gòu)化為果糖，反應(yīng)線路如圖1所示.木薯首先解聚生成葡萄糖單元，葡萄糖在Al2(SO4)3/乙醇-水體系催化下轉(zhuǎn)化為果糖，果糖作為中間產(chǎn)物在Lewis酸和乙醇作用下進一步轉(zhuǎn)化為乙酰丙酸乙酯和乙酰丙酸.Zhu等[16]采用1H NMR研究了離子效應(yīng)對果糖轉(zhuǎn)化為2,5-二甲基呋喃（HMF）過程的影響，1H NMR譜圖顯示加入 1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物[BMim]Cl，果糖上與碳骨架直接連接的質(zhì)子的化學(xué)位移均相應(yīng)向低場移動，而HMF的H-1和羥基質(zhì)子的化學(xué)位移向低場移動，證明了陽離子[BMim]+和果糖上質(zhì)子相互作用，促進果糖脫水，陰離子Cl-和HMF中H-1及羥基質(zhì)子形成氫鍵，起到穩(wěn)定HMF結(jié)構(gòu)，抑制其結(jié)焦和縮聚的作用.此外，在催化解聚路徑和機理研究中，為明晰化學(xué)反應(yīng)的歷程，對各產(chǎn)物進行追本溯源，最為常用的方法是采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記法對標(biāo)記元素進行追蹤，探究有機反應(yīng)路徑[17].Choudhary等[18]采用同位素標(biāo)記的1H NMR技術(shù)對水介質(zhì)中均相催化劑（CrCl3和AlCl3）和多相催化劑（Snβ）催化葡萄糖異構(gòu)化制備果糖的機理進行研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖C-2位的氘原子（D-2）轉(zhuǎn)移到D-果糖的C-1位，該信息證實了3組催化體系中葡萄糖異構(gòu)化為果糖的氫化物轉(zhuǎn)移機理是一致的.這為后續(xù)生物質(zhì)解聚條件的選擇及反應(yīng)路徑的調(diào)控提供了理論指導(dǎo)，也為類似的機理研究提供了借鑒思路.

圖1 在混合介質(zhì)（10%H2O和90%乙醇）中用Al2(SO4)3催化木薯解聚的反應(yīng)路線（根據(jù)文獻[15]修改）Fig. 1 Reaction route of cassava depolymerization catalyzed by Al2(SO4)3 in mixed medium (10% H2O and 90% ethanol)(Reproduced from Ref. [15])

1H NMR不僅可以用于結(jié)構(gòu)定性，而且可以進行定量分析，因而應(yīng)用極為廣泛.Shin等[19]利用1H NMR技術(shù)研究了木材碳水化合物中木聚糖的含量.在酸水解過程中，楊木木粉中的木聚糖單體脫水為糠醛，糠醛在酸性條件下進一步降解或縮合.為了利用1H NMR波譜進行碳水化合物成分的精確分析，糠醛及其反應(yīng)產(chǎn)物均計為木糖.糠醛1H NMR譜峰顯示在芳香區(qū)（δH6.7~9.5），端基質(zhì)子的信號位于δH4.4~5.4，根據(jù)端基質(zhì)子和糠醛的信號峰積分，得出木聚糖轉(zhuǎn)化率為 0.66.定量1H NMR技術(shù)為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究提供了有效信息，但該方法誤差相對較大，不適用于痕量分析.

雖然使用1H NMR技術(shù)能夠較快獲得生物質(zhì)中的質(zhì)子信息，且信噪比很高，但不可忽視的是1H NMR譜圖重疊嚴(yán)重，難以深度解析生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，不能滿足清晰認(rèn)識生物質(zhì)解聚路徑和規(guī)律的挑戰(zhàn)和需求，因此往往需要結(jié)合其他表征手段，如13C NMR、2D NMR、GC-MS、LC-MS、FT-IR等進行結(jié)構(gòu)分析.如鄭秋闿等[20]在對三種不同來源木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特性進行研究時，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的1H NMR譜圖信號重疊，難以精確區(qū)分各質(zhì)子的特征峰，于是通過結(jié)合 FT-IR圖譜中各紅外吸收峰的歸屬實現(xiàn)了木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的定性分析，發(fā)現(xiàn)松木的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)以愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)單元為主，玉米稈和樺木木質(zhì)素以紫丁香基和愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)單元為主，為闊葉林和針葉林木質(zhì)素的差異性研究及綜合利用提供了理論依據(jù).

2.2 13C NMR

13C NMR譜圖可以反映化合物中的碳原子類型（如羰基碳、氰基碳），還能提供化合物碳骨架等信息，從而提供更多分子結(jié)構(gòu)信息.如根據(jù)13C NMR譜中伯、仲、叔和季碳的特征峰信息，可推斷出植物中二萜生物堿類化合物的骨架結(jié)構(gòu)，利用化合物中季碳及其取代基信號能有效鑒別C19-二萜生物堿[21].

近年來，13C NMR主要用于催化體系下木質(zhì)素的組成和化學(xué)特性分析，進行催化解聚的過程和機理研究.許鳳等[22]利用13C NMR研究有機溶劑對溶解的麥草木質(zhì)素的物理化學(xué)特性影響.芳香區(qū)信息表明相比有機醇溶液，有機酸溶液的脫木素作用更加廣泛，能選擇性降解麥草中的纖維素、木質(zhì)素及半纖維素.張通等[23]進行了酶解秸稈殘渣中木質(zhì)素提取方法的研究，利用13C NMR和1H NMR分析了堿溶酸析法、高沸點醇提取法、甲酸乙酸法及堿性乙醇法從殘渣中提取的木質(zhì)素組成差異，發(fā)現(xiàn)四種提取方法得到的木質(zhì)素產(chǎn)品具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì).

13C同位素標(biāo)記NMR波譜可以分辨并精確定量不同種類的化合物，是一種十分有效的非破壞性分析手段.近年來，它已逐漸成為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和機理研究的得力工具.在對Ni@C催化劑選擇性催化纖維素制備乙醇的研究中，Liu等[24]對中間產(chǎn)物葡萄糖進行13C同位素標(biāo)記，通過13C NMR追蹤反應(yīng)過程并研究其反應(yīng)機理，如圖2所示：分別在1號位、2號位和5號位同位素標(biāo)記的葡萄糖在δC16.8和δC57.5（對應(yīng)于乙醇中碳原子）有信號峰，其中5號位標(biāo)記的葡萄糖中乙醇信號相對較弱，而在3號位和4號位標(biāo)記的葡萄糖則沒有乙醇的信號，證明了Ni@C催化劑催化斷裂葡萄糖C-C鍵具有選擇性，乙醇通過定向斷裂葡萄糖C-2-C-3鍵和脫除C-1位置羥基生成.該研究首次利用非貴金屬催化劑實現(xiàn)了纖維素一步轉(zhuǎn)化為乙醇，在木質(zhì)纖維素催化制備乙醇領(lǐng)域取得了突破.Hilde等[25]通過13C標(biāo)記的甲酸研究了甲酸和木質(zhì)素在高溫條件下的反應(yīng)途徑，13C NMR譜圖顯示，用標(biāo)準(zhǔn)甲酸制備的木質(zhì)素油和用13C標(biāo)記的甲酸制備的木質(zhì)素油在13C NMR譜圖中位于δC170~180，這一范圍內(nèi)的信號來自羰基鍵，表明甲酸中的碳原子最終存在于生物油的羰基，并形成芳香酸等化合物.這項工作表明甲酸參與木質(zhì)素反應(yīng)過程并生成了生物油，說明甲酸是木質(zhì)素轉(zhuǎn)化的氫供體和解聚促進劑.謝益民等[26]發(fā)現(xiàn)，在13C-6標(biāo)記的葡萄糖和纖維二糖的存在下，松柏醇葡萄糖苷在過氧化物酶催化脫氫聚合過程中與碳水化合物之間形成了化學(xué)鍵，且葡萄糖的C-6與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元以苯甲醚鍵連，從而闡明了植物纖維細(xì)胞壁中木質(zhì)素與聚葡萄糖化學(xué)鍵的鏈接方式和木質(zhì)素催化脫氫的反應(yīng)機理.

圖2 同位素標(biāo)記的葡萄糖氫解實驗的13C NMR譜圖.(a) δC 15~18局部圖；(b) δC 54~60局部圖[24]Fig. 2 13C NMR spectra from isotope-labeled glucose hydrogenolysis experiment at (a) δC 15~18 and (b) δC 54~60 regions[24]

定量13C NMR可以實現(xiàn)生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和官能團的定量計算，用于分析生物質(zhì)處理過程中的組分、結(jié)構(gòu)變化和演變機理等.Yoshihirosano等[27]研究了磨木和木粉中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增加，總羥基的數(shù)量減少，酚羥基的含量增加，β-O-4鏈接鍵結(jié)構(gòu)的含量顯著降低，β-5和β-β鏈接鍵結(jié)構(gòu)的含量變化不大，木質(zhì)素發(fā)生的解聚可能與β-芳醚鍵的均裂解有關(guān).該研究進一步闡明在沒有酸催化劑的情況下，溶液中陽離子促進木質(zhì)素解聚的機理，這對推進造紙制漿工藝具有積極意義.Wen等[28]通過定量13C NMR研究酶解原料、離子液體催化劑和預(yù)處理酶解的三種殘渣（木質(zhì)素）的含量差異，發(fā)現(xiàn)離子液體催化的木質(zhì)素在δC58~62處的特征峰減弱，證明離子液體可催化木質(zhì)素的β-O-4鍵部分?jǐn)嗔眩瑢?dǎo)致分子量減小，初步表明了離子液體中木質(zhì)素的解離規(guī)律.

交叉極化魔角旋轉(zhuǎn)（CP/MAS）[29,30]可以消除偶極子的相互作用和化學(xué)位移的異向性，樣品不必進行分離和溶解等處理，就可以直接進行測試.CP/MAS13C NMR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物質(zhì)及其組分的結(jié)構(gòu)研究，通過比較反應(yīng)前后譜圖中13C NMR信號的變化可以確定化學(xué)反應(yīng)路徑.該方法為木質(zhì)纖維原料結(jié)構(gòu)的定性和初步定量提供了可能，是傳統(tǒng)定量表征手段的有效補充.陳琳等[31]應(yīng)用CP/MAS13C NMR研究了黃孢原毛平革菌降解玉米秸稈木質(zhì)素的過程，發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)纖維素酶酶解后，作為木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元主要鏈接方式的β-O-4鍵基本沒有斷裂；木質(zhì)素單位苯環(huán)的甲氧基單元碳的含量稍有增加，紫丁香基單元/愈創(chuàng)木基單元值降低，推斷反應(yīng)過程中紫丁香基優(yōu)先參與反應(yīng).Evstigneyev等[32]利用CP/MAS13C NMR測定了木質(zhì)素中烷基芳基鍵，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素中烷基-O-芳基間鍵的含量與δC96~68區(qū)域的信號積分面積之間存在較強的線性相關(guān).這表明CP/MAS13C NMR可同時測定可溶性和不溶性木質(zhì)素中烷基-O-芳基的含量，也可同時測定可溶性產(chǎn)物中甲氧基的含量.

優(yōu)勢互補的固體和液體NMR技術(shù)的結(jié)合被證明是分析生物質(zhì)混合物最有效的方法之一，目前已被廣泛用于檢測植物的聚合物組分及衍生物全組分.固體NMR可用于固體生物質(zhì)或者不溶性組分的檢測，而液體NMR通常用于從生物質(zhì)樣品解聚過程中提取的可溶性組分的檢測.Cheng等[33]將棉花殼和棉花毛刺化學(xué)改性為羧甲基化產(chǎn)物，并分別通過固體和液體13C NMR技術(shù)對改性前后的水溶性和不溶性組分的變化進行了研究.固體NMR譜圖表明，不溶性組分主要為纖維素和羧甲基纖維素（CMC），位于δC179處的信號相對較小，說明纖維素羧甲基化水平較低；棉花殼樣品羧甲基化水平高于棉花毛刺.液體NMR譜圖表明，可溶性組分主要為CMC和羧甲基化木聚糖（CMX）.其中，棉花殼可溶性組分含有約56% CMX和44% CMC，棉花毛刺可溶性組分中含有37% CMX和63% CMC.固體和液體NMR技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用為生物質(zhì)全組分的研究提供了表征新途徑.

但由于13C核的NMR靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1H核，因此，13C NMR在微量或痕量樣品的測定方面具有局限性.如纖維素和半纖維結(jié)晶度高、溶解度低，其13C NMR譜圖信號微弱，難以進行特性分析.為了提高信噪比，往往需要盡可能增加采樣次數(shù)、延長測試時間、提高樣品濃度.如在測定玉米芯和桉樹在酶催化水解釋放的微量半纖維素的13C NMR譜圖時，為了得到信噪比較高的譜圖，采樣次數(shù)提高到了4.5萬次，測試時間長達44 h[34].

2.3 31P NMR

31P NMR技術(shù)日漸成熟，在測定含磷化合物的分子結(jié)構(gòu)方面，具有重要作用[35].木質(zhì)素中含有不穩(wěn)定質(zhì)子的基團與含磷試劑可生成含磷衍生物，用31P NMR可以研究羧基、羥基等官能團的含量和組成.

31P NMR定量技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物煉制資源羥基的表征，用于測定不同工業(yè)技術(shù)解聚的木質(zhì)素的官能團，包括草本木質(zhì)素、硬木木質(zhì)素和軟木木質(zhì)素.目前亞磷酸化后的31P NMR測定是木質(zhì)纖維羥基的含量和組成測定的最常用方法，它可以同時提供芳香羥基，以及分別與紫丁香基、愈創(chuàng)木基和對羥基苯基單元相連酚羥基的信息.Meng等[36]報道了木質(zhì)素中羥基的31P NMR定量分析，研究中使用的內(nèi)標(biāo)N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺（NHND）具有與木質(zhì)素衍生組分易分離的化學(xué)位移.2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧膦雜戊環(huán)（TMDP）衍生的羥基基團，包括脂肪族、紫丁香基、愈創(chuàng)木基、對羥基苯基和羧酸羥基，具有本質(zhì)上不同的化學(xué)位移，這使得它們能夠被31P NMR區(qū)分和定量.如圖3所示，以NHND為內(nèi)標(biāo)，木質(zhì)素中各種羥基（例如脂肪族、酚類和羧酸）和TMDP之間反應(yīng)的亞磷酸化產(chǎn)物：δP144~150處為脂肪族羥基的反應(yīng)產(chǎn)物，δP137~141為愈創(chuàng)木基型、紫丁香基型和對羥基苯基型酚羥基的反應(yīng)產(chǎn)物，δP134~136為羧酸上羥基的反應(yīng)產(chǎn)物.通過上述方法可以快速分析木質(zhì)素中羥基的組成及其含量.Wen等[37]對亞磷酸化楊木木質(zhì)素進行31P NMR定量分析，并研究了離子液體預(yù)處理過程中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)δP146~149處的吸收峰變?nèi)?，表明離子液體促進了木質(zhì)素的脫水反應(yīng)，導(dǎo)致脂肪族羥基減少；溫度升高，δP141~144吸收峰變強，表明木質(zhì)素中的芳基醚鍵斷裂，解聚被繼續(xù)強化，縮合度進一步增加.該研究增強了對離子液體預(yù)處理過程中木質(zhì)素解聚過程的理論研究，有助于木質(zhì)素預(yù)處理化學(xué)工藝的改進.

圖3 以N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺（NHND）為內(nèi)標(biāo)，2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧膦雜戊環(huán)（TMDP）衍生后的楊木硬木木質(zhì)素的定量31P NMR譜（根據(jù)文獻[36]修改）Fig. 3 The quantitative 31P NMR spectrum of a hardwood poplar lignin derived with TMDP using NHND as an internal standard(Reproduced from Ref. [36])

Argyropoulos等[38]結(jié)合定量31P NMR與自旋捕獲技術(shù)測定了羥基、烷基和?；杂苫幕瘜W(xué)位移.通過氮氧磷化合物 5-二異丙氧基-磷酰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DIPPMPO）與以氧為中心和以碳為中心的自由基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的自由基加合物，并在含磷內(nèi)標(biāo)物的存在下，使用31P NMR對其進行了準(zhǔn)確定量.這項工作證明了DIPPMPO自旋俘獲與定量31P NMR結(jié)合使用，是一種有效的識別和量化許多自由基物種的工具.此外，Chen等[39]還通過定量31P NMR分析了不同生長年限木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)與單次纖維素酶酶解木質(zhì)素樣品（CEL）相比，兩次纖維素酶酶解木質(zhì)素樣品（DEL）不僅具有較高的產(chǎn)量，而且具有相似的結(jié)構(gòu)特征.研究還發(fā)現(xiàn)生長期1年的DEL中對羥基苯甲酸鹽（PB）和對羥基苯基單元（H）含量高，而生長期5年的DEL的S/G比值高.該項工作通過不同生長年限楊樹木質(zhì)素樣品的結(jié)構(gòu)表征可以更好地了解木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)特征在不同時期的變化規(guī)律.

與傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù)相比，31P NMR在測定羥基方面具有獨特的優(yōu)勢，不僅譜圖分辨率高，而且基于31P NMR測定的木質(zhì)素中羥基，其結(jié)果準(zhǔn)確度通常高于其他獨立技術(shù)（如FT-IR/熱解、電導(dǎo)滴定法、1H NMR和13C NMR），并且需要的樣品量少、實驗時間短.但該方法也有其局限性,例如內(nèi)標(biāo)物信號與木質(zhì)素重疊，且內(nèi)標(biāo)物易降解.

31P脈沖法[40]是一種基于脈沖長度的濃度測定方法，其原理是NMR信號強度和探頭90°脈沖長度的乘積與樣品濃度呈正比.該方法可用于生物質(zhì)中羥基含量的測定，并且測定結(jié)果與利用內(nèi)標(biāo)法所得結(jié)果一致.31P脈沖法簡化了樣品制備，即無需樣品前處理和添加內(nèi)標(biāo)，因此消除了內(nèi)標(biāo)引起的信號重疊和內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定性等問題.目前該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于木質(zhì)素羥基的組成及其含量的測定.Lagerquist等[40]利用31P脈沖法測定了松樹和樺木樣品木質(zhì)素的組成及其含量.31P脈沖法是以磷酸三苯酯（TPP）作為外部標(biāo)準(zhǔn)，三份樺木和松木的木質(zhì)素樣品采用TMDP亞磷酸化后進行測定，分別對脂肪族羥基（δP150.0~145.0）、C-5取代酚羥基（δP145.0~140.3）、紫丁香基酚羥基（δP140.3~137.0）、羧基（δP136.0~134.0）的測定值進行對比，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.08，證明采用31P脈沖法在木質(zhì)素的羥基含量測定的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定和準(zhǔn)確.

2.4 2D HSQC

二維NMR技術(shù)，尤其是2D HSQC技術(shù)越來越廣泛的用于生物質(zhì)解聚過程、產(chǎn)物含量結(jié)構(gòu)和催化機理研究[41-42].

二維NMR實驗為了得到較高的信噪比，樣品濃度應(yīng)盡可能大，如：1H-13C HSQC實驗中需要的木質(zhì)素的樣品量一般不至少20 mg，掃描時間通常達到10 h以上.木質(zhì)素的2D HSQC譜圖一般分為脂肪族區(qū)、側(cè)鏈區(qū)和芳香區(qū)三個部分：脂肪族區(qū)主要是側(cè)鏈的CH2和CH3以及木質(zhì)素的乙酰基的信號；側(cè)鏈區(qū)主要是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元之間鏈接鍵的信號區(qū)，如芐基醚鍵、β-O-4鍵、β-β鍵、β-5鍵、C-O和C-C鏈接鍵指紋信號，側(cè)鏈區(qū)的信息為認(rèn)識產(chǎn)物結(jié)構(gòu)（特別是低聚）和判斷解聚斷鍵提供強有力的佐證支撐；芳香區(qū)主要是苯環(huán)結(jié)構(gòu)上C-H信號[43].劉競等[44]采用1H-13C HSQC對松木粉在 NaVO3-DMSO-H2SO4體系中的氧化過程進行研究，發(fā)現(xiàn)在側(cè)鏈區(qū)和芳香區(qū)，木質(zhì)素大量鏈接鍵斷裂，芳環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，并進一步被氧化為醌類化合物.該研究為木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化及利用提供理論依據(jù)，促進了木質(zhì)素的高值化利用.李兵云等[45]采用1H-13C HSQC進行了粉丹竹磺化化學(xué)機械漿（SCMP）木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變化分析，研究表明粉丹竹SCMP的木質(zhì)素是由愈創(chuàng)木基型、紫丁香基型和對-羥基苯基型等三種木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元組成，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的鏈接方式主要是β-O-4醚鍵.通過SCMP中木素的結(jié)構(gòu)和鏈接方式的表征，對竹子制漿有著重要的理論指導(dǎo)意義.呂微等[46]利用1H-13C HSQC研究EtOAc/H2O雙相溶劑體系中Ru/C耦合MgCl2催化玉米秸稈水解殘渣解聚過程，并推導(dǎo)其化學(xué)鍵斷裂和降解路徑.如圖4所示，通過2D HSQC譜圖芳香區(qū)提供的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)碎片（G、H、S、FA、P-CE、T、E和B）指紋信息、側(cè)鏈區(qū)（δH1.0~5.5，δC5~90）保留的鏈接鍵（β-O-4，β-5，β-β）結(jié)構(gòu)指紋信息、基于電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）獲得的碎片分子和單體芳香物分子量結(jié)果的互相佐證，他們推測了該體系下玉米秸稈水解殘渣解聚的主要反應(yīng)路徑：大部分β-O-4、α-O-4、β-5、4-O-5的C-O醚鏈接鍵、部分α-β、β-γ的 C-C鏈接鍵，以及側(cè)鏈的α-OH、β-OH和γ-OH鏈接鍵發(fā)生斷裂生成低聚物和單體.該項研究推進了農(nóng)林廢棄物的再利用和生物質(zhì)生產(chǎn)芳香生物精煉飼料的關(guān)鍵科學(xué)及核心工藝的進步.

圖4 Ru/C耦合MgCl2協(xié)同催化玉米秸稈水解殘渣解聚得到的非揮發(fā)性組分的2D HSQC譜（根據(jù)文獻[46]修改）Fig. 4 2D HSQC NMR spectra of non-volatile components obtained from the depolymerization of the hydrolyzed residue of corn straw over Ru/C combined with MgCl2 catalysts (Reproduced from Ref. [46])

2D HSQC定量技術(shù)能實現(xiàn)木質(zhì)素各結(jié)構(gòu)單元及各種化學(xué)鏈接鍵的定性和定量分析，可用于生物質(zhì)解聚產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析和解聚路徑推理研究[47].Delrio等[48]應(yīng)用1H-13C HSQC定量技術(shù)研究黃麻纖維中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明從黃麻纖維中分離的木質(zhì)素中β-O-4芳醚鍵占總側(cè)鏈的 72%，β-β樹脂型鍵占總側(cè)鏈的16%，其中β-O-4芳醚鍵在堿性蒸煮過程中易被裂解.在有關(guān)大豆細(xì)胞壁中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)研究中，Yang等[49]對四種木質(zhì)素（磨碎木質(zhì)素、木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物、纖維素酶木質(zhì)素和酶水解殘余酶木素）進行1H-13C HSQC定量分析，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物中包含大量β-O-4芳基醚鍵（在芳香族單元中含量為 84.4%），其餾分中木質(zhì)素和木聚糖之間的苯基糖苷（PhGlc）鍵含量相對較高（在芳香族單元中含量為4.39%）；四種木質(zhì)素的主要結(jié)構(gòu)為β-O-4芳基醚和樹脂醇.Lin等[50]通過1H-13C HSQC方法評估凋落物分解期間紫外線輻射對細(xì)胞壁化學(xué)性能的影響，定量分析了與光降解有關(guān)的凋落物化學(xué)組分之后發(fā)現(xiàn)：在1年的分解過程中，紫外線照射組凋落物中半纖維素的含量（23.8%）低于紫外線屏蔽組中的含量（25.9%），而細(xì)胞可溶性組分、纖維素、木質(zhì)素組分在紫外光照射組含量（33.4%、38.8%、4%）均高于紫外光屏蔽組（32.7%、37.9%、3.5%）.以上結(jié)果表明凋落物降解以微生物分解為主，凋落物的半纖維素和木質(zhì)素G單位明顯減少.紫外光輻射造成木質(zhì)素部分降解，表現(xiàn)為β-芳基醚和木質(zhì)素H單元的損失，但木質(zhì)素組分的變化并不明顯.該項對凋落物中木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)和含量變化的研究有助于更好地理解光分解和碳循環(huán)過程.

高分辨魔角旋轉(zhuǎn)異核單量子相關(guān)技術(shù)（HR-MAS 2D HSQC）在生物組織結(jié)構(gòu)及其裂解產(chǎn)物研究中具有獨特的優(yōu)勢，可進行木質(zhì)纖維全組分表征.由于固體木質(zhì)纖維樣品分子不能自由運動，自旋之間的耦合較強，如13C核在外磁場中吸收峰很寬，會掩蓋其他精細(xì)特征譜峰，造成其信號可能被錯誤歸屬.Mori等[51]采用HR-MAS 2D-HSQC測定楊樹的降解產(chǎn)物，在脂肪族區(qū)域，楊樹的降解產(chǎn)物有各種氨基酸、乙醇、蘋果酸，膽堿、乙醇胺和葡萄糖等.在進行信號匹配的過程中，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中有多個候選降解物，例如，谷氨酰胺α、β和γ的三個 NMR 信號（δH3.757，δC57.160）、（δH2.128，δC68.947））和（δH2.442，δC73.535）分別與數(shù)據(jù)庫中10種、3種和2種候選降解物相匹配.為避免上述信號錯誤匹配，在產(chǎn)物組分分析中，結(jié)合三維核磁共振技術(shù)（3D HCCH-COSY）確定了降解物對應(yīng)的譜峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)降解物信號匹配，完成降解產(chǎn)物的準(zhǔn)確定性.

3D NMR技術(shù)可以解決NMR譜圖信號重疊的問題，但缺點是其測試時間過長.2D NMR和3D NMR的結(jié)合使用可實現(xiàn)生物質(zhì)降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息的精準(zhǔn)分析.Mori等[51]結(jié)合應(yīng)用2D HSQC和3D TOCSY對纖維素降解的(1,4)-β-d-吡喃葡萄糖甙進行了結(jié)構(gòu)分析，如圖5所示，δC60.2、74.6、79.9、74.6、72.7和 62.7（折疊譜δC102.7）分別對應(yīng)(1,4)-β-d-吡喃葡萄糖甙中的 C1~C6，橫線連接1H-13C-13C-1H交叉峰，垂直虛線連接 3D和 2D光譜之間的相應(yīng)信號.圖 5(a)叉號顯示由 3D HCCH-TOCSY分配的(1,4)-β-d-吡喃葡萄糖甙中C1-C6信號.圖5(b)為6個沿C1~C6化學(xué)位移的13C軸切取3D1H-1H-13C譜的1H-1H平面，通過3D-TOCSY譜圖[圖5(b)]信息，在2D HSQC譜圖[圖5(a)]中可清晰確定(1,4)-β-d-吡喃葡萄糖甙多個鍵的關(guān)系（即多個相鄰關(guān)聯(lián)）.2D和3D NMR技術(shù)的互補應(yīng)用實現(xiàn)了生物質(zhì)及其衍生物的結(jié)構(gòu)、含量的準(zhǔn)確分析，有助于轉(zhuǎn)化過程的研究，為農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)高品質(zhì)化學(xué)品提供重要的參考數(shù)據(jù).

圖 5 DMSO/吡啶體系中提取的楊樹降解產(chǎn)物(1,4)-β-d-吡喃葡萄糖甙的(a)2D HSQC和(b)切片 3D TOCSY譜圖（根據(jù)文獻[51]修改）Fig. 5 (a) 2D HSQC and (b) slice 3D-TOCSY NMR spectra of (1,4)-β-d-Glcp derived from poplar extracted in DMSO/pyridine (Reproduced from Ref. [51])

3 主要問題及展望

近年來，隨著NMR理論、技術(shù)和儀器制造水平的不斷發(fā)展，NMR技術(shù)在生物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用的越來越廣泛，已成為生物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析、組分確定、反應(yīng)機理探討等研究中不可或缺的表征手段，但是NMR技術(shù)目前在應(yīng)用中還存在一些問題，有待科學(xué)家們進一步探索和完善.生物質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的高分子化合物，NMR譜圖比較復(fù)雜，尤其是對于分子結(jié)構(gòu)差異細(xì)微的立體異構(gòu)化合物，在很窄的化學(xué)位移里面很難區(qū)分其細(xì)微的差別.因此，要區(qū)分生物質(zhì)中的結(jié)構(gòu)相似的組分需要借助多維NMR技術(shù)，如2D HSQC可直觀可靠的測定生物質(zhì)的成分和比例，HR-MAS 2D HSQC可以測定完整的木質(zhì)纖維降解產(chǎn)物，3D NMR可以解決2D NMR實驗中信號重疊問題.上述NMR方法的結(jié)合可實現(xiàn)生物質(zhì)的降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分析，有助于更好研究生物質(zhì)的組分及解聚變化過程.但3D NMR技術(shù)對儀器分辨率與靈敏度的要求較高，一定程度上限制了其在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的廣泛應(yīng)用；原位NMR技術(shù)可以跟蹤化合物反應(yīng)的過程，精準(zhǔn)的反映化合物轉(zhuǎn)化中產(chǎn)物的組分和結(jié)構(gòu)變化，利用該技術(shù)可以進行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化歷程和反應(yīng)機理的研究.但生物質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件相對苛刻、過程產(chǎn)物難以及時分離等諸多因素制約了原位NMR技術(shù)在其轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用；17O NMR可以通過O原子的化學(xué)環(huán)境變化推斷生物質(zhì)中含O原子的羥基、醚基、羰基等基團的化學(xué)鍵的斷裂及變化規(guī)律，進而研究生物質(zhì)功能基團的結(jié)構(gòu)差異及轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過程.由于17O原子天然豐度較低，其NMR信號弱且易受其他原子的干擾，致使17O NMR在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用較少；近年來，多種測試技術(shù)的聯(lián)用拓展了 NMR在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用，如 LC-NMR和LC-MS-NMR聯(lián)用技術(shù)通過調(diào)整色譜可以將生物質(zhì)降解的產(chǎn)物逐一分離，然后再進行NMR測試，這種技術(shù)有助于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的分析和解聚機理研究.

相信未來隨著儀器分析技術(shù)水平的不斷完善及上述相關(guān)問題的解決，NMR技術(shù)在生物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用會更加廣泛和深入，可以更快速準(zhǔn)確的為生物質(zhì)的全面、完整的組分確定和轉(zhuǎn)化過程研究提供理論依據(jù).

利益沖突

無