Alpha-突觸核蛋白與完整線粒體相互作用的NMR研究

余錦波，張 偲，張則婷，徐國華*，李從剛

1. 中國科學院生物磁共振分析重點實驗室，波譜與原子分子物理國家重點實驗室（中國科學院 精密測量科學與技術創(chuàng)新研究院），湖北 武漢 430071；2. 中國科學院大學，北京 100049

引 言

帕金森綜合征密切相關蛋白alpha-突觸核蛋白（α-synuclein）[1-3]是一種天然無結構蛋白.該蛋白由140個氨基酸殘基構成，其氨基酸序列包含三個部分：第1~60位氨基酸殘基組成的N端，該區(qū)易和膜相互作用，具有形成α-螺旋結構的傾向；第 61~95位氨基酸殘基組成的非淀粉樣成份區(qū)（NAC），該區(qū)包含較多疏水氨基酸，具有形成β-片層結構的趨向；第 96~140位氨基酸殘基組成的羧基端，該區(qū)富含酸性氨基酸，在生理pH下帶有大量負電荷，大部分情況下此區(qū)域為無規(guī)則卷曲[4].

線粒體是真核細胞中重要的細胞器，是細胞進行有氧呼吸制造能量的主要場所[5].其結構由內到外分為基質、線粒體內膜、膜間隙和線粒體外膜[6,7].雖然目前帕金森癥發(fā)病機制尚不完全清楚，但普遍認為，線粒體功能障礙也是主要原因之一.有研究證實α-synuclein的過表達能改變線粒體的形態(tài)、動力學及損害線粒體正常功能[8-14]，但其作用機制并不明確.圍繞這一問題已有研究組開展了α-synuclein與線粒體模擬膜及分離提取的完整線粒體的相互作用的研究，使用線粒體模擬膜的研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein與線粒體膜的相互作用依賴于心磷脂，α-synuclein能與心磷脂含量高（約18%）的線粒體內膜作用，而與心磷脂含量低（<1%）的線粒體外膜并不相互作用[15-17]，且N端在與線粒體的結合中發(fā)揮重要作用，但α-synuclein具體的作用位點仍不十分清楚.

核磁共振（NMR）技術是研究生物大分子相互作用的有效方法[18,19]，它能夠對樣品進行無損傷的檢測[20-25]，并提供詳細的生物大分子作用位點信息.本文利用NMR方法研究了α-synuclein與新鮮提取的完整線粒體的相互作用，證實NMR方法是研究蛋白質與完整線粒體相互作用的有效方法.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鉀（EDTA·2K）、蔗糖、苯甲基磺酰氟（PMSF）購自國藥集團化學試劑有限公司.對蛋白質進行同位素標記所用的15NH4Cl和13C-glucose購自Cambridge Isotope Laboratories，Inc.提取線粒體所用的實驗動物為六周齡的SD品系雄性大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司.蛋白免疫印跡（Western Blotting）檢測所用的標樣蛋白銅鋅超氧化物歧化酶（SOD1）和細胞色素C氧化酶亞基6c（COX6c）及其對應一抗抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；鼠抗兔IgG二抗抗體購自Abcam plc.；顯色所用增強型二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自生工生物工程有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司.線粒體染色所用的特異性紅色熒光染料（Mito Tracker? Red CMXRos）購自Thermo Fisher Scientific Inc.

1.2 蛋白樣品的表達與純化

非標記、15N標記和15N/13C雙標記的α-synuclein的表達與純化依照文獻[26,27]所述的方法進行.

表達方法簡述如下：將整合有α-synuclein基因的重組質粒Pt7-7轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 rpm的搖床中培養(yǎng)，然后在LB液體培養(yǎng)基（非標記的α-synuclein）或M9培養(yǎng)基（15N標記與15N/13C雙標記的α-synuclein）中擴大培養(yǎng)，至OD600為0.8時加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（Sigma，終濃度為1.0 mmol/L）進行誘導表達，5 h后收菌.

純化方法簡述如下：將菌體用高壓細胞破碎儀裂解，然后沸水浴20 min，14 000 rpm、4 ℃條件下離心取上清；加入硫酸鏈霉素（終濃度為10 mg/mL）旋轉混勻30 min，14 000 rpm、4 ℃條件下離心取上清（該步驟用于沉淀球蛋白）；再加入硫酸銨（終濃度為360 mg/mL）旋轉混勻30 min，沉淀目的蛋白α-synuclein，14 000 rpm、4 ℃條件下離心30 min收集蛋白沉淀. 將蛋白沉淀溶解后首先用陰離子交換柱DEAE純化，再用分子篩S100（GE Healthcare）進一步純化，純化后的蛋白用脫鹽柱（GE Healthcare）脫鹽后凍干存放備用.

1.3 大鼠肝臟線粒體的提取

大鼠肝臟線粒體的提取參閱文獻[28]進行.其方法簡要如下：取六周齡左右的雄性SD大鼠采用拖頸法處死，剪開大鼠胸腹部表皮與肌肉以暴露腹腔，取大鼠肝臟并稱重，將剪碎的肝臟放入提取緩沖液（按照10 mL緩沖液/g肝組織的比例加入，緩沖液的組成為10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA·2K和320 mmol/L蔗糖，pH 7.4），并在勻漿器中勻漿，整個操作在冰上進行，然后通過差速離心法提取線粒體，1 300 g、4 ℃條件下、低速離心10 min，以沉淀組織碎片等非線粒體成分，7 000 g、4 ℃條件下、高速離心10 min，收集線粒體成分，低速離心和高速離心循環(huán)3次以得到高純度的線粒體.

1.4 線粒體的純度檢測與計數(shù)

1.4.1 線粒體的純度檢測

COX6c可作為線粒體的標志蛋白，而SOD1可作為胞質組分的標志蛋白.利用蛋白質免疫印跡技術對所提取的線粒體分別進行這兩個標志蛋白的檢測即可確定線粒體的純度[29].首先將所提取的線粒體進行超聲裂解釋放出線粒體內的蛋白質，之后將線粒體裂解液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后進行轉膜與封閉，再分別用COX6c與SOD1相應的一抗抗體進行孵育，最后經(jīng)過二抗抗體孵育與顯色觀察所提取的線粒體內是否含有被檢測的蛋白，并確定線粒體純度.

1.4.2 線粒體的計數(shù)

線粒體的計數(shù)基于線粒體內的總蛋白濃度進行測算[30].首先將所提取的線粒體超聲裂解，之后使用 BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定線粒體內蛋白質的總濃度，再根據(jù)蛋白質濃度推算出肝臟中線粒體的數(shù)目.

1.4.3 線粒體熒光染色與熒光共聚焦實驗

我們用250 nmol/L的線粒體紅色熒光染料（Mito Tracker? Red CMXRos）對所提取的線粒體染色30 min，然后用提取緩沖液清洗線粒體3次，制片后使用配備了63倍油鏡的LEICA TCS Sp8熒光共聚焦顯微鏡進行觀察，激發(fā)波長為579 nm，發(fā)射波長為599 nm.

1.5 NMR樣品制備與實驗

α-synuclein稀溶液樣品的制備：將凍干的α-synuclein蛋白樣品溶解在含10%重水的提取緩沖液中至終濃度為0.015 mmol/L.α-synuclein與線粒體孵育樣品（即α-synuclein線粒體樣品）的制備：用500 μL的α-synuclein稀溶液重懸自6 g大鼠肝組織新鮮提取的線粒體.為防止α-synuclein的降解，我們也制備了添加 PMSF的樣品（即α-synuclein-PMSF樣品和α-synuclein-PMSF線粒體樣品），無論是稀溶液樣品還是蛋白與線粒體孵育樣品，PMSF的終濃度均為1 mmol/L.

所有NMR實驗均在配備了5 mm TCI H-C/N-D CryoProbeTM超低溫探頭的Bruker 850 MHz譜儀上完成，實驗溫度為279 K.1H-15N SOFAST-HMQC實驗直接維（1H）和間接維（15N）譜寬分別為10 204 Hz和2 240 Hz，兩維中心分別位于δH4.70和δN119.0，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1=1 024×256，累加次數(shù)為288，弛豫等待時間為0.1 s.α-synuclein在279 K下的信號歸屬通過稀溶液中15N和13C雙標記的樣品來完成，采集了HN(CO)CA、HNCA、CBCA(CO)NH和HNCACB等三共振實驗進行主鏈歸屬.NMR數(shù)據(jù)通過Topspin3.2處理，在Sparky中進行分析.化學位移變化通過(1)式計算得到：

其中Δδ1H代表1H的化學位移變化，Δδ15N代表15N的化學位移變化.

1.6 NMR實驗后樣品檢測

α-synuclein-PMSF線粒體樣品在完成 NMR實驗后，進行了 SDS-PAGE和蛋白質免疫印跡檢測.離心分離上清液與線粒體沉淀，向上清液與沉淀中加入 5×上樣緩沖液并沸水浴，之后進行SDS-PAGE，觀察線粒體是否破損.在經(jīng)過轉膜與封閉后，用α-synuclein一抗抗體進行孵育，最后經(jīng)過二抗抗體孵育與顯色，觀察α-synuclein在與線粒體混合后是否發(fā)生降解.

2 結果與討論

2.1 線粒體的純度和活力

線粒體的純度可用線粒體特征蛋白COX6c和胞質特征蛋白SOD1來表征.我們利用蛋白質免疫印跡技術對提取的線粒體分別進行了這兩個蛋白的檢測，結果顯示提取的線粒體含有 COX6c而不含有SOD1 [圖1(a, b)]，表明提取的線粒體純度較高，未受到胞質組分的干擾.

為表征提取的線粒體的活性，我們用線粒體膜電位依賴的紅色熒光探針（Mito Tracker? Red CMXRos）對所提取的線粒體進行了染色，并用熒光共聚焦顯微鏡進行了觀察.如圖1(c)～1(e)所示，明場與線粒體染色的熒光圖疊加良好，表明所提取的線粒體純度較高、活性良好.

2.2 α-synuclein與完整線粒體相互作用

我們配制了α-synuclein線粒體樣品，來研究α-synuclein與完整線粒體的相互作用.為確定α-synuclein和線粒體的個數(shù)比在一個合理范圍，我們首先利用線粒體的總蛋白量估算了線粒體的數(shù)目.BCA法測定結果顯示每克肝組織所提取的線粒體含有1.68 mg蛋白質，依據(jù)每毫克蛋白質對應的線粒體數(shù)目約為 8.1×109個（Schmitt等[30]的研究結果），可以推算出我們所提取的線粒體數(shù)目約為1.36×1010個/g肝組織. 而本研究使用了來自6 g肝組織的線粒體，即線粒體的數(shù)目已達8.16×1010個，以及0.015 mmol/L的α-synuclein蛋白，蛋白與線粒體的個數(shù)比為56 000:1.假設線粒體是直徑為1 μm的球體，α-synuclein能與線粒體進行相互作用，且相互作用模型是前60個氨基酸[圖2(a)]形成α-螺旋結構嵌在膜表面，則一個線粒體表面可容納170 000個蛋白分子（遠大與56 000），因此我們實驗中所設計的蛋白與線粒體的個數(shù)比是合理的.

圖1 分離提取的大鼠肝臟線粒體純度和活力的表征. (a)線粒體特征蛋白COX6c和(b)胞質特征蛋白SOD1的蛋白免疫印跡檢測結果，最右孔道為SOD1標樣作為陽性對照，用以表征線粒體的純度，Mito表示線粒體；(c)~(e)熒光共聚焦表征線粒體的活性，(c)為明場圖，(d)為熒光共聚焦圖，(e)為明場與熒光共聚焦疊加圖Fig. 1 The analysis of isolated mitochondrial purity and viability from the liver of rat. (a) The COX6c component and (b) SOD1 component were detected by western blotting (SOD1 standard sample as positive control in figure (b)),showing the mitochondrial purity. (c)~(e) Mitochondrial viability characterized by fluorescence confocal microscopy:(c) Bright field; (d) Isolated mitochondria were stained with Mito Tracker? Red CMXRos whose accumulation is dependent upon the mitochondrial membrane potential (MMP); (e) Overlay of figure (c) and figure (d)

在此基礎上，我們采集了α-synuclein線粒體樣品的1H-15N SOFAST-HMQC譜[圖2(b)].如圖所示，相比于稀溶液，部分氨基酸殘基的信號強度呈現(xiàn)明顯減弱，并未出現(xiàn)新的信號峰，化學位移未表現(xiàn)出明顯移動.基于稀溶液中獲得的信號指認結果（該蛋白除5個脯氨酸外，可實現(xiàn)約90%的信號歸屬），我們對信號強度和化學位移進行了詳細分析[圖3(a, b)]，結果顯示化學位移變化很小，數(shù)值幾乎均小于0.005，但α-synuclein N端（1～60）信號強度出現(xiàn)了明顯減弱[圖3(a)]，表明該段殘基能與線粒體相互作用，這種相互作用使得蛋白的轉動相關時間變長，橫向弛豫速率增加，信號強度減弱.

α-synuclein非常容易降解，特別是在含有豐富的蛋白酶的線粒體中，但 PMSF可以有效抑制α-synuclein的降解，且并不影響線粒體的功能[31].為排除蛋白酶泄露降解α-synuclein導致 N端信號強度降低的可能性，我們又采集了α-synuclein-PMSF線粒體樣品的NMR譜圖，以及稀溶液中含有和不含 PMSF的α-synuclein樣品的譜圖[圖 2(c, d)].可以看出 PMSF本身對蛋白沒有影響[圖2(c)].添加PMSF的α-synuclein線粒體樣品相比于不添加的樣品也未呈現(xiàn)出明顯差異[圖2(d)].同樣，我們也對α-synuclein-PMSF線粒體樣品的信號強度和化學位移進行了詳細分析[圖3(c, d)]，結果顯示仍然是僅α-synuclein N端（1～60）信號強度出現(xiàn)了明顯減弱[圖3(c)]，即與α-synuclein線粒體樣品所得結果相同.

圖2 不同條件下α-synuclein的1H-15N SOFAST-HMQC譜圖對比. (a) α-synuclein 的氨基酸序列，組成N端的第1~60的殘基用紅色表示；(b) α-synuclein稀溶液（藍色）與α-synuclein線粒體樣品（紅色）的譜圖疊加；(c)含有（綠色）與不含有（藍色）1 mmol/L PMSF的α-synuclein稀溶液的譜圖疊加；(d) α-synuclein線粒體樣品（紅色）與α-synuclein-PMSF線粒體樣品（青色）的譜圖疊加Fig. 2 1H-15N SOFAST-HMQC spectra of α-synuclein under different conditions. (a) The amino acid sequence of α-synuclein, the N-terminus region (1~60) are colored in red; (b) Spectral overlay of α-synuclein in absence (blue) and presence (red) of intact mitochondria, the partial peaks of which signal intensity attenuated in the presence of intact mitochondria are marked; (c) Spectral overlay of α-synuclein with (green) and without (blue) PMSF(1 mmol/L) in diluted solution; (d) Spectral overlay of α-synuclein with (cyan) and without (red) PMSF (1 mmol/L) in the presence of intact mitochondria

為了進一步驗證結果的可靠性，我們又對NMR實驗完成后的α-synuclein-PMSF線粒體樣品執(zhí)行了SDS-PAGE和蛋白免疫印跡分析（圖4）.SDS-PAGE結果顯示上清中只看到α-synuclein蛋白的條帶，并不能看到來自線粒體蛋白的條帶，表明 NMR實驗后線粒體的完整性良好[圖 4(a)].蛋白免疫印跡檢測的結果顯示α-synuclein未發(fā)生降解，并且α-synuclein絕大多數(shù)分布在上清中，分布在沉淀中的非常少[圖 4(b)].這一方面表明α-synuclein與線粒體的作用比較弱，一方面也表明絕大多數(shù)α-synuclein并未在與線粒體共同孵育的過程中進入線粒體內部，而仍是分布在線粒體的外面.即使假設分布于沉淀中的α-synuclein全部進入線粒體內部（通常情況下，沉淀中的α-synuclein可能一部分分布于線粒體外膜上與之結合，一部分進入線粒體內部），其所占總蛋白濃度的比例也是非常低的.另外，在該NMR實驗中我們使用的蛋白濃度僅0.015 mmol/L，考慮到NMR技術低靈敏的特點，我們所觀察到的NMR信號應是來自于所占比例高的位于線粒體外的α-synuclein組分，而不可能是所占比例非常低的進入線粒體內的α-synuclein組分（濃度過低難以達到檢測限）.由此，我們推測本實驗中所觀察到的α-synuclein與完整線粒體的相互作用是來自于α-synuclein與線粒體外膜，而不是蛋白進入線粒體，進而與線粒體內膜產(chǎn)生的相互作用.

圖3 α-synuclein線粒體樣品氨基酸殘基信號強度與化學位移變化結果. 相比于稀溶液，α-synuclein線粒體樣品氨基酸殘基的(a)強度變化和(b)化學位移變化；相比于稀溶液，α-synuclein-PMSF線粒體樣品氨基酸殘基的(c)強度變化和(d)化學位移變化（注：圖中沒有數(shù)值的空白部分主要為因譜峰重疊嚴重導致難以獲取準確信號強度的氨基酸殘基）Fig. 3 The analysis of residue resolved NMR signal intensity and chemical shift change of α-synuclein in the presence of mitochondria(the values of NMR signal intensity ratio and chemical shift changes are shown as blank for the residues whose signal intensity can not be accurately obtained due to the overlap of spectral peaks). (a) NMR signal intensity ratio (Iα-synuclein-mito/Iα-synuclein) of α-synuclein in the presence and absence of mitochondria; (b) Chemical shift changes of α-synuclein in presence of mitochondria compared to α-synuclein; (c)NMR signal intensity ratio (Iα-synuclein-PMSF-mito/Iα-synuclein) of α-synuclein with PMSF in the presence of mitochondria and α-synuclein; (d)Chemical shift changes of α-synuclein with PMSF in the presence of mitochondria compared to α-synuclein

圖4 α-synuclein-PMSF線粒體樣品的(a) SDS-PAGE和(b)蛋白免疫印跡檢測結果. 圖中Control表示α-synuclein的標準品對照，Sample表示α-synuclein-PMSF線粒體樣品，Supernatant表示α-synuclein-PMSF線粒體樣品離心后的上清，Precipitate表示α-synuclein-PMSF線粒體樣品離心后的沉淀Fig. 4 (a) SDS-PAGE and (b) Western-blotting analysis of α-synuclein with PMSF in the presence of intact mitochondria (a)SDS-PAGE analysis showing integrity of mitochondria; (b) Western-blotting analysis showing that α-synuclein is undegraded; Control:α-synuclein standard sample, Sample: α-synuclein with PMSF in the presence of intact mitochondria, Supernatant: the supernatant of the sample (α-synuclein with PMSF in the presence of intact mitochondria) that was centrifuged, Precipitate: the precipitate of the sample that was centrifuged

另外，我們的研究表明α-synuclein與線粒體的相互作用主要是通過其N端來實現(xiàn)，這一特征與我們及其他研究組前期所報道[20,32-34]的α-synuclein與生物模擬膜相互作用所表現(xiàn)出來的特征非常相似，表明它們的作用模式非常相似，即α-synuclein與線粒體的相互作用很可能仍是通過其N端形成α-螺旋結構的形式與線粒體膜相互作用.但是在信號強度降低的幅度和所波及的范圍上與之前的報道也表現(xiàn)出一些差別：我們前期報道[32]的α-synuclein與1-棕櫚?；?2-油?；蚜字? 1-棕櫚酰-2-油?；字幔≒OPC/POPA）組成的單層小脂質體（SUV）的相互作用中，信號強度降低最明顯的N端前 10個殘基衰減達到了>90%的水平，其信號衰減范圍延伸到了蛋白的前 120個殘基；而在α-synuclein與線粒體的作用中，信號強度降低主要發(fā)生在N端，并未進一步延伸到NAC區(qū)，且其信號強度降低最明顯的 N端前 10個殘基的衰減在約 75%的水平，表明這種相互作用可能不及α-synuclein與POPC/POPA組成的SUV的相互作用強.

我們的研究顯示NMR觀察到的α-synuclein與線粒體的相互作用應來自于α-synuclein與線粒體外膜，這與其他研究組通過模擬線粒體外膜組分研究其與α-synuclein的相互作用所得結果并不相同.其他研究組的研究結果顯示α-synuclein與心磷脂含量低的線粒體外膜（<1%）并不相互作用[15-17].這可能是因為已有的研究使用的是磷脂組裝的SUVs或單層大泡脂質體（LUV）來模擬線粒體外膜（模擬線粒體外膜中不含心磷脂成分），而完整的線粒體外膜除磷脂組分外，還含有其他組分（如脂蛋白、糖等）.另外，模擬外膜的曲率與完整線粒體也存在差異.這些都可能導致模擬線粒體外膜并不能真實反映完整線粒體的實際情況，從而造成研究結果的差異.這也體現(xiàn)出使用完整線粒體開展研究的重要性.

3 結論

本文通過NMR技術研究了α-synuclein與完整線粒體的相互作用，發(fā)現(xiàn)α-synuclein能與完整線粒體外膜相互作用，且作用區(qū)域主要位于α-synuclein N端前1~60個氨基酸殘基.這一研究證實NMR方法是研究蛋白質與完整線粒體相互作用的有效方法.

利益沖突

無