Bacillus subtilis轉(zhuǎn)錄因子CtsR蛋白中clpC操縱子結(jié)合區(qū)域的NMR研究

陳曉雯，黃碧玲，黃少華＃，趙玉芬,2,3*

1. 寧波大學(xué) 新藥技術(shù)研究院，浙江 寧波 315211；2. 廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005；3. 清華大學(xué) 化學(xué)系，生命有機(jī)磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

引 言

蛋白質(zhì)和核酸是組成生命體的重要生物大分子，它們各自具有結(jié)構(gòu)特征和特定功能，二者間的相互作用構(gòu)成了諸如生長、繁殖、運(yùn)動(dòng)、遺傳和代謝等生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，在整個(gè)基因組表達(dá)調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用.作為一種重要的動(dòng)態(tài)生物調(diào)節(jié)過程，蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)最普遍、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，具有非常重要的生物學(xué)意義[1].

磷酸化修飾可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象、活性以及蛋白-蛋白間相互作用等，從而對信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞分裂等生物學(xué)過程發(fā)揮重要的調(diào)控功能[2].目前，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的 20種氨基酸中有 9種氨基酸的側(cè)鏈可以發(fā)生磷酸化修飾，主要分為以下四種類型：O-磷酸化（以P-O鍵連接的磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）、N-磷酸化（以P-N鍵連接的磷酸化組氨酸、精氨酸和賴氨酸）、COO-磷酸化（以P-(CO)O鍵連接的磷酸化天冬氨酸或谷氨酸），以及S-磷酸化（以P-S鍵連接的磷酸化半胱氨酸）[3].由于O-磷酸化比較穩(wěn)定，易于檢測、分析，因此當(dāng)前對于蛋白質(zhì)磷酸化的研究主要集中于O-磷酸化[4].近年來，O-磷酸化蛋白激酶作為藥物靶點(diǎn)已被廣泛研究，基于這些研究，目前已經(jīng)有30多種新藥被開發(fā)并成功上市[5].雖然相比于 O-磷酸化，N-磷酸化的研究才剛剛起步，但有研究[4]表明 N-磷酸化在生命過程中可能發(fā)揮著重要作用，因此亟需我們從多方面開展相關(guān)基礎(chǔ)研究，從而為后續(xù)新藥研發(fā)提供新的思路.

2009年，Clausen等[6]報(bào)道了枯草芽孢桿菌中的第一個(gè)也是目前唯一一個(gè)精氨酸激酶McsB.他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌響應(yīng)熱刺激時(shí)，McsB磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CtsR蛋白中結(jié)合clpC操縱子區(qū)域的Arg62（R）位點(diǎn)，導(dǎo)致CtsR與clpC操縱子發(fā)生解離，從而啟動(dòng)clpC相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄.將R突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼岷螅蛔凅wCtsR蛋白則不能結(jié)合clpC操縱子.由此說明位于CtsRβ轉(zhuǎn)角的R位點(diǎn)是調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵殘基.此外，他們解析了CtsR與clpC操縱子的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)R側(cè)鏈結(jié)合于clpC操縱子的小溝.蛋白質(zhì)精氨酸磷酸化不僅在調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程中具有重要意義，而且作為被ClpCP蛋白酶降解的標(biāo)簽，在蛋白質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用[7].2012年，YwlE蛋白被鑒定為精氨酸磷酸酶，同時(shí)它也是McsB的互補(bǔ)調(diào)節(jié)蛋白[8]；2014年，Clausen等在敲除ywlE基因的枯草芽孢桿菌中鑒定出包含217個(gè)精氨酸磷酸化位點(diǎn)的134個(gè)蛋白，這些蛋白可能在細(xì)菌蛋白質(zhì)量控制、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核酸修飾、核糖體功能等方面發(fā)揮重要作用[9]；2015年和2016年，鼠抗和兔抗的精氨酸磷酸化多克隆抗體相繼被開發(fā)[10,11]，盡管目前沒有應(yīng)用的相關(guān)案例，但是可以預(yù)見抗體的開發(fā)將會(huì)給精氨酸磷酸化的生理功能研究帶來極大的便利[12].

蛋白質(zhì)精氨酸磷酸化改變了精氨酸側(cè)鏈的電荷性質(zhì)，即精氨酸側(cè)鏈由于共價(jià)連接了帶有負(fù)電荷的磷酸從而由正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷；同時(shí)磷酸化改變了蛋白構(gòu)象，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)與 DNA的相互作用，從而發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能.然而，精氨酸磷酸化如何影響多肽或蛋白構(gòu)象仍然未知，且精氨酸磷酸化調(diào)控CtsR中clpC操縱子結(jié)合區(qū)域（KRGGGG）與clpC操縱子相互作用的機(jī)制尚未完全清楚.目前研究蛋白質(zhì)磷酸化主要使用質(zhì)譜技術(shù)，而質(zhì)譜需要對樣品進(jìn)行酸化處理，這對于高能且不耐酸的P-N修飾是極其不利的，極易導(dǎo)致N-磷酸化的丟失.而用于核磁共振（NMR）檢測的樣品可保持在接近生理pH條件下，這對于不耐酸的精氨酸磷酸化的研究極為有利，而且 NMR技術(shù)可以研究動(dòng)態(tài)過程，如磷酸化與去磷酸化過程等.

本文以轉(zhuǎn)錄因子CtsR中結(jié)合clpC操縱子的區(qū)域（KRGGGG）為研究對象（圖1），通過1H NMR、1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-15N HSQC以及1H-13C HSQC譜圖對該片段進(jìn)行化學(xué)位移歸屬（化學(xué)位移的指認(rèn)均對應(yīng)圖1中的原子編號(hào)），以期通過獲得的NMR數(shù)據(jù)從原子水平為精氨酸磷酸化調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究提供可靠基礎(chǔ).

圖1 KRGGGG肽段的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of KRGGGG

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

含有內(nèi)標(biāo)物四甲基硅烷（TMS）的氘代水（D2O，氘代率為99.9%）購于青島騰龍微波科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH=6.33）由本課題組配制，分別稱量0.06 g的KH2PO4、0.36 g的Na2HPO4·2H2O、2 g的NaCl和0.05 g的KCl，將其溶解在200 mL去離子水中.

1.2 肽段和DNA片段樣品制備

KRGGGG肽段樣品委托上海生工生物工程有限公司合成并純化，溶于磷酸鹽緩沖液中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

clpC操縱子中與KRGGGG肽段結(jié)合的DNA片段委托上海生工生物工程有限公司合成，兩條互補(bǔ)單鏈DNA序列分別為5′-ATTAAGGTCAAA-3′和5′-TTTGACCTTAAT-3′，兩條單鏈DNA分別溶于去離子水，取相同體積混合至一起，在95 ℃的溫度下變性5 min后，再在室溫下退火2 h獲得雙鏈DNA（dsDNA）溶液，保存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.3 電子圓二色譜（ECD）滴定實(shí)驗(yàn)

使用JASCO-1700型ECD譜儀.將190 μL濃度為63.44 μmol/L DNA溶液置于1 mm比色皿中，以濃度為3 mmol/L KRGGGG溶液滴定DNA溶液.每次向DNA溶液中滴加2μL KRGGGG溶液，直至ECD信號(hào)不再變化，即滴定達(dá)到飽和.掃描波長范圍為200~320 nm，掃描速率為50 nm/min.

1.4 NMR實(shí)驗(yàn)

向KRGGGG溶液中加入10%（V/V）D2O，最終配制成濃度為8.38 mmol/L的肽段溶液，轉(zhuǎn)移至外徑為2.5 mm的微量NMR樣品管中，全部NMR實(shí)驗(yàn)均在配備了5 mmZ梯度場反向四共振超低溫探頭的Bruker Ascend 600 MHz譜儀上完成，實(shí)驗(yàn)溫度恒定在298 K，由Bruker VT-200溫控器控制，控溫精度為 ±0.1 K.1H、13C和15N核的工作頻率分別為600.38、150.96和60.83 MHz，1H NMR譜寬為11 904.8 Hz.二維NMR實(shí)驗(yàn)均采用Bruker標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列，用zgwegp脈沖序列壓制溶劑水峰.其中1H-1H COSY譜脈沖序列選擇為cosydfesgpph，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-1H TOCSY譜脈沖序列選擇為mlevesgpph，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-15N HSQC譜脈沖序列選擇為hsqcfpf3gpphwg，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-13C HSQC譜脈沖序列選擇為hsqcfpf3gpphwg，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1= 2 048×256，累加32次.對各自由感應(yīng)衰減（FID）信號(hào)進(jìn)行傅里葉變換，隨后對1H-1H COSY和1H-1H TOCSY譜圖使用窗函數(shù)QSINE進(jìn)行處理；對1H-15N HSQC和1H-13C HSQC譜圖使用窗函數(shù)SINE進(jìn)行處理.

1.5 NMR滴定實(shí)驗(yàn)

向KRGGGG溶液中加入10% (V/V)的D2O，最終配置成濃度為1.07 mmol/L的肽段溶液，將200 μL KRGGGG溶液置于外徑為2.5 mm的微量NMR樣品管中，以濃度為5.35 mmol/L的DNA溶液在298 K溫度下滴定.每次向KRGGGG溶液中滴加2 μL DNA溶液，直至信號(hào)不再變化，即滴定達(dá)到飽和.

2 結(jié)果與討論

2.1 ECD實(shí)驗(yàn)

雙鏈DNA具有特征性的CD信號(hào)，即存在206 nm和248 nm處的兩個(gè)負(fù)峰以及218 nm和274 nm處的兩個(gè)正峰，因此DNA的信號(hào)變化可用于表征DNA是否與其它分子存在相互作用.如圖2所示，隨著向DNA體系中不斷加入KRGGGG，位于206 nm處CD信號(hào)逐漸減弱；而位于248 nm處的CD信號(hào)則逐漸增強(qiáng)，表明KRGGGG的加入導(dǎo)致DNA的CD信號(hào)發(fā)生變化，說明兩者之間存在相互作用（后文將討論基于NMR數(shù)據(jù)分析所得到的二者相互作用信息）.因此，本文所研究的KRGGGG肽段與DNA相互作用，可作為研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用模型肽.

圖2 KRGGGG滴定DNA的ECD光譜Fig. 2 ECD spectra of KRGGGG titration to DNA

2.2 1H核的歸屬

綜合分析該片段（KRGGGG）的1H NMR譜（圖3）和1H-1H TOCSY譜（圖4），可知δH8.83歸屬為R2-NHα.在1H-1H TOCSY譜中：δH1.83和4.38均與R2-NHα相關(guān)，由化學(xué)位移規(guī)律，δH1.83可歸屬為R2-Hβ，δH4.38可歸屬為R2-Hα；δH1.69、δH3.22與R2-Hα相關(guān)，可歸屬為R2-Hγ、Hδ；δH7.18與R2-Hδ相關(guān)，可歸屬出R2-NHε.1H-1H COSY譜（圖5）中，δH1.69與δH3.22的相關(guān)，以及δH1.83與δH1.69的相關(guān)，驗(yàn)證了上述歸屬.

圖3 KRGGGG溶液的1H NMR譜Fig. 3 1H NMR spectrum of KRGGGG solution

圖4 KRGGGG溶液的1H-1H TOCSY譜Fig. 4 1H-1H TOCSY spectrum of KRGGGG solution

圖5 KRGGGG溶液的1H-1H COSY譜Fig. 5 1H-1H COSY spectrum of KRGGGG solution

由于G4與G5化學(xué)環(huán)境相同，δH8.37/8.38可歸屬為G4-NHα/G5-NHα；在1H-1H TOCSY譜中：δH4.01/4.02與G4-NHα，G5-NHα相關(guān)，可分別歸屬為G4-Hα/G5-Hα；同時(shí)G3，G4與G5的Hα也處于相似化學(xué)環(huán)境，因此G3-Hα應(yīng)與G4-Hα/G5-Hα有相近的化學(xué)位移，于是δH3.98可歸屬為G3-Hα，在1H-1H TOCSY譜中，δH8.66與G3-Hα相關(guān)，可歸屬為G3-NHα；此外也獲得了δH3.83與δH8.08的相關(guān)信號(hào)，于是可以將δH3.83與δH8.08分別歸屬為G6-Hα和G6-NHα.

由于K1-Hα與K1-Hβ、Hγ、Hδ相關(guān)，從1H-1H TOCSY譜的局部圖可將δH4.07歸屬為K1-Hα.在1H-1H COSY譜中：δH1.92與K1-Hα相關(guān)，歸屬為K1-Hβ；δH1.45與K1-Hβ相關(guān)，歸屬為K1-Hγ；δH1.70與K1-Hγ相關(guān)，歸屬為K1-Hδ；δH3.01與K1-Hδ相關(guān)，歸屬為K1-Hε.

2.3 15N核的歸屬

在1H-15N HSQC（圖6）譜中：δN124.60與R2-NHα相關(guān)，歸屬為R2-NαH；δN111.72與G3-NHα相關(guān)，歸屬為G3-NαH；δN109.16/108.91與G4-NHα，G5-NHα相關(guān)信號(hào)，歸屬為G4-NαH，G5-NαH；δN114.16與G6-NHα相關(guān)，歸屬為G6-NαH；δN84.72與R2-NHε相關(guān)，歸屬為R2-NεH.

2.4 13C核的歸屬

在1H-13C HSQC譜（圖 7）中：δC42.54與 G4-Hα、G5-Hα、G3-Hα相關(guān)，歸屬為G4-Cα、G5-Cα、G3-Cα；δC43.00與G6-Hα相關(guān)，歸屬為G6-Cα；δC30.65與K1-Hδ相關(guān)，歸屬為K1-Cβ；δC21.04與K1-Hγ相關(guān)，歸屬為K1-Cγ；δC26.47與K1-Hδ相關(guān)，歸屬為K1-Cδ；δC39.35與K1-Hε相關(guān)，歸屬為 K1-Cε；δC28.12與R2-Hδ相關(guān)，歸屬為R2-Cβ；δC24.43與R2-Hγ相關(guān)，歸屬為 R2-Cγ；δC40.64與R2-Hδ相關(guān)，歸屬為R2-Cδ；δC52.90與K1-Hα相關(guān)，歸屬為K1-Cα（由于信號(hào)較弱，譜圖要切很低才能看到）；由于R2-Hα信號(hào)在實(shí)驗(yàn)過程中信號(hào)被部分壓制，因此未獲得R2-Cα信號(hào).

圖6 KRGGGG溶液的1H-15N HSQC譜Fig. 6 1H-15N HSQC spectrum of KRGGGG solution

圖7 KRGGGG溶液的1H-13C HSQC譜Fig. 7 1H-13C HSQC spectrum of KRGGGG solution

通過對以上NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，完成了轉(zhuǎn)錄因子CtsR中與DNA相互作用區(qū)域KRGGGG片段的1H NMR、13C NMR以及15N NMR信號(hào)歸屬，其詳細(xì)化學(xué)位移列于表1.

表1 KRGGGG片段的1H、13C以及15N化學(xué)位移Table 1 1H, 13C and 15N chemical shifts of KRGGGG

2.5 DNA滴定KRGGGG

為了進(jìn)一步證明KRGGGG與DNA相互作用，我們進(jìn)行了DNA滴定KRGGGG的NMR實(shí)驗(yàn)（圖8）.

圖8 DNA滴定KRGGGG的1H NMR譜圖Fig. 8 1H NMR spectra of DNA titration to KRGGGG

從圖中可以看出，隨著DNA的不斷滴加，多肽的1H NMR信號(hào)逐漸發(fā)生變化.主鏈R2-NHα、G3-NHα，G4-NHα、G5-NHα和側(cè)鏈的 R2-NHε向低場移動(dòng)；G6-NHα和側(cè)鏈 G6-Hα向高場移動(dòng).說明這些原子的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，而這些變化源于它們與DNA的相互作用.

3 結(jié)論

本文通過綜合分析一維NMR譜圖以及多種同核和異核相關(guān)二維NMR譜圖，歸屬了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉(zhuǎn)錄因子CtsR中clpC操縱子結(jié)合區(qū)域KRGGGG的1H、13C和15N化學(xué)位移，獲得了該肽段溶液結(jié)構(gòu)的較為完整的NMR數(shù)據(jù)，為精氨酸磷酸化的調(diào)控機(jī)制研究提供了可靠科學(xué)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

致謝

感謝國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（91856126）以及福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門大學(xué)）開放基金資助項(xiàng)目（2021001）對本文的資助.

利益沖突

無