葛葉多酚的提取工藝及其抗氧化性質(zhì)

唐婷范　朱家慶　李榮彬　馮軍　黃芳麗　梁杰婷　田玉紅　李曉慧　程昊

摘? 要：采用回流法提取葛葉中的多酚，用福林酚法測(cè)定葛葉多酚含量，通過(guò)精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)驗(yàn)證適用性，對(duì)葛葉多酚的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行研究，并利用單因素實(shí)驗(yàn)研究對(duì)葛葉多酚得率的影響.結(jié)果顯示葛葉多酚最佳提取工藝為：溶劑pH值為4、料液比1∶30、70 ℃水浴2.0 h，提取2次，精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.27%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.94%，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.66%，此條件下葛葉多酚得率為2.22%;葛葉多酚對(duì)DPPH·和·OH具有較強(qiáng)的清除作用，最大清除率分別為80.99%和76.24%.回流法提取葛葉多酚工藝合理，操作簡(jiǎn)單，且提取后的葛葉多酚有較強(qiáng)的抗氧化性，為葛葉多酚的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)性研究.

關(guān)鍵詞：葛葉;多酚;提取工藝;抗氧化性

中圖分類號(hào)：TQ91? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.017

0引言

葛葉來(lái)源于植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi.的葉，據(jù)醫(yī)學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，葛根的莖、葉、花、果、根均可入藥[1]，《別錄》記載其“主金瘡止血”[2].葛葉中含有多酚類化合物.王淑惠等[3]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）聯(lián)用，對(duì)不同生長(zhǎng)月份的葛葉揮發(fā)油進(jìn)行鑒定，得到20多個(gè)成分，其中就包含多酚類物質(zhì).多酚是植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚羥基結(jié)構(gòu)[4].植物多酚由于其有效的抗氧化特性以及在預(yù)防各種氧化應(yīng)激相關(guān)疾?。ɡ绨┌Y）中的顯著效果而引起越來(lái)越多的關(guān)注[5-9].不同植物多酚類提取物的利用和開(kāi)發(fā)已成為食品和醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的主要領(lǐng)域[10-12]，多酚的提取工藝是其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié).

目前多酚的提取方法有很多[13-14]，常用的有微波輔助提取法[15]、超臨界流體萃取法、超聲波提取法[16]等.其中微波輔助提取法不適合高溫敏感物質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)破壞提取物分子結(jié)構(gòu);超臨界流體萃取法對(duì)設(shè)備要求高，成本大;超聲波提取法機(jī)械能耗大，溶劑消耗過(guò)快.與此相比的回流提取法[17]，操作工藝簡(jiǎn)單，不會(huì)造成太多的資源浪費(fèi)，且成本低，是一種常用的植物多酚提取方法.宋力等[18]采用回流法提取菠蘿皮中的多酚，并與微波法、超聲波法等4種方法作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)回流法提取的多酚抗氧化清除率最高.

近年來(lái)，對(duì)葛根多酚的研究大多數(shù)集中在根部，對(duì)葛葉多酚研究較少.本實(shí)驗(yàn)以葛葉作為原料，利用回流提取法提取葛葉中多酚，采用福林酚法[19]測(cè)定葛葉中多酚的含量，通過(guò)精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證適用性，并對(duì)葛葉多酚得率和多酚提取液的抗氧化性能進(jìn)行研究.

1材料與方法

1.1?? 材料與試劑

葛葉，選用廣西北海野葛的葉（2019年8月采收）;沒(méi)食子酸，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;福林酚試劑、水楊酸，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;碳酸鈉，分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司;二苯基苦基肼自由基，分析純，WaKo公司;無(wú)水乙醇，分析純，臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司.

1.2?? 儀器與設(shè)備

V2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;AR124CN分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司;TDL-80-2B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司;ZY-LDG12真空冷凍干燥機(jī)：上海紫裕生物科技有限公司.

1.3?? 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1?? 葛葉原料預(yù)處理

選擇品質(zhì)良好無(wú)蟲(chóng)害的優(yōu)質(zhì)葛葉，將其洗凈放入60 ℃烘箱烘干，烘干后的葛葉研磨打碎，備用.

1.3.2?? 葛葉多酚含量的測(cè)定

采用福林酚法[19]測(cè)定葛葉里的多酚含量，利用福林酚的強(qiáng)氧化性與多酚發(fā)生藍(lán)色反應(yīng)，并利用分光光度計(jì)在745 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè).用沒(méi)食子酸作為標(biāo)定物質(zhì)，利用標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量.

1.3.3沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用分析天平稱量11.00 mg（±0.10 mg）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容到100 mL容量瓶中配制成質(zhì)量濃度0.11 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液;取0.2 mL、 ?0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入1.5 mL福林酚試劑和2.0 mL 10% Na2CO3溶液定容于25 mL容量瓶，混合均勻避光反應(yīng)30 min后在745 nm處測(cè)其吸光度[15]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.4精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

1）精密度實(shí)驗(yàn)

用移液管吸取葛葉多酚提取液2.0 mL至 25 mL容量瓶中，加入1.5 mL福林酚試劑和 ?2.0 mL 10% Na2CO3溶液后用蒸餾水定容，混合均勻避光反應(yīng)30 min，在745 nm處不間斷測(cè)量6次吸光度[20].

2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取多酚提取液2.0 mL至25 mL容量瓶中，加入福林酚試劑1.5 mL和10% Na2CO3溶液2.0 mL 后用蒸餾水定容，混合均勻避光反應(yīng)30 min，每隔?? 2 min在745 nm處測(cè)量6次吸光度.

3）加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別吸取2.0 mL葛葉多酚提取液至5個(gè)25 mL容量瓶中，在每個(gè)容量瓶中分別加入不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并計(jì)算平均回收率和RSD值.

1.3.5?? 葛葉多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)考察

1）溶劑pH對(duì)多酚得率的影響

調(diào)配pH值為3、4、5、6、7的蒸餾水溶劑，用電子天平稱量2.00 g預(yù)處理過(guò)的葛葉，加入料液比為1∶30的不同pH值的溶劑，在50 ℃下加熱回流2 h，提取一次[21]，按“1.3.3”步驟測(cè)定吸光度，分析數(shù)據(jù)繪制葛葉多酚得率與pH值曲線圖.

2）提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

稱量2.00 g處理過(guò)的葛葉，加入料液比為1∶30的pH值為4的溶劑，在50 ℃下加熱回流? 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測(cè)定吸光度，分析數(shù)據(jù)繪制葛葉多酚得率與提取時(shí)間曲線圖.

3）料液比對(duì)多酚得率的影響

稱量2.00 g處理過(guò)的葛葉，加入不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），pH值為4的溶劑，在50 ℃下加熱回流2 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測(cè)定吸光度，分析數(shù)據(jù)繪制葛葉多酚得率與料液比曲線圖.

4）提取溫度對(duì)多酚得率的影響

稱量2.00 g處理好的葛葉，加入料液比為 ??1∶30的pH值為4的溶劑，在不同溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）下加熱回流2 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測(cè)定吸光度，分析數(shù)據(jù)繪制葛葉多酚得率與提取溫度曲線圖.

5）提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響

稱量2.00 g處理好的葛葉，加入料液比為1∶30的pH值為4的溶劑，在70 ℃下加熱回流 2 h，提取不同次數(shù)（1、2、3、4），按“1.3.3”步驟測(cè)定吸光度，分析數(shù)據(jù)繪制葛葉多酚得率與提取次數(shù)曲線圖.

1.3.6葛葉多酚的抗氧化性質(zhì)研究[22-24]

1）葛葉多酚對(duì)DPPH·的清除率

取不同濃度配置好的葛葉樣液2.0 mL，加入0.3 mmol/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液2.0 mL，混合搖勻后避光放置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度[A1];用2.0 mL無(wú)水乙醇代替DPPH·無(wú)水乙醇溶液測(cè)定吸光度[A2];再以2.0 mL蒸餾水代替葛葉樣液測(cè)定吸光度[A0]，用無(wú)水乙醇做為空白參比.將樣液替換為標(biāo)準(zhǔn)液按上述步驟做出標(biāo)準(zhǔn)物曲線與樣液清除率作比較.平行測(cè)定3次求平均值.DPPH·自由基清除率公式如下：

[DPPH·自由基清除率=1-A1-A2A0×100%]（1）

2）葛葉多酚對(duì)·OH的清除率

取試管加入l mL 9.0×10-3 mol/L FeSO4溶液，再加入2.0 mL相同濃度的水楊酸溶液，最后加入 2.0 mL 8.8×10-3 mol/L雙氧水溶液，混合均勻后暗處?kù)o置30 min，在525 nm處測(cè)定吸光度[A0]，不加雙氧水溶液作為空白對(duì)照.另取試管依次加入 l.0 mL FeSO4溶液、2.0 mL水楊酸溶液、2.0 mL葛葉樣液和2.0 mL雙氧水溶液，在上述條件下測(cè)吸光度[A1].按上述在加葛葉樣液不加雙氧水溶液條件下測(cè)吸光度[A2]. [A1] 和[A2]以蒸餾水作參比，平行測(cè)定3次求平均值.·OH自由基清除率公式如下：

[·OH自由基清除率=A0-A1-A2A0×100%]? （2）

1.3.7數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定3 次取平均值以減小實(shí)驗(yàn)誤差.使用Origin 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪制圖表.

2結(jié)果與分析

2.1?? 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，將標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度與所測(cè)吸光度值擬合，得到回歸方程[y=0.089x-0.001]，[R2=0.999 8]，說(shuō)明該曲線具有良好的回歸性.

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得到多酚的得率計(jì)算公式：

[多酚得率=A+0.0010.089×Vm×100%] ??（3）

式中：[A]為提取液吸光度;[V]為提取液體積，mL;[m]為樣品質(zhì)量，g.

2.2精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率結(jié)果分析

精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1—表3.由表1—表3得知，葛葉多酚提取液的精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率RSD分別為0.27%、0.94%、1.66%，此方法的平均回收率為95.50%.通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果說(shuō)明該測(cè)定方法適用于葛葉多酚的測(cè)定.

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1溶劑pH對(duì)多酚得率的影響

圖2為不同pH值對(duì)多酚得率的影響.

由圖2可以看出，在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，葛葉多酚得率在pH=4時(shí)最大，達(dá)到1.32%.原因可能是植物里的多酚作為鹽類存在，當(dāng)在酸性條件下容易使單寧酸游離出來(lái)，相比酸性環(huán)境單寧在堿液中更容易浸出且易氧化，所以選取pH=4的溶劑較合適.

2.3.2?? 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

圖3為不同提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響.

由圖3可以看出，多酚最高得率為1.41%，提取時(shí)間為2.0 h.在2.0 h內(nèi)得率逐漸增大的原因可能是在時(shí)間較短的情況下，葛葉與水的接觸時(shí)間不夠，并沒(méi)有從葛葉中提取出全部的產(chǎn)物.在2.0 h后下降是因?yàn)橐呀?jīng)提取出的多酚接觸空氣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，在高溫下容易被氧化，所以得率會(huì)逐漸地減小[25].選擇時(shí)間2.0 h較合適.

2.3.3料液比對(duì)多酚得率的影響

圖4為不同料液比對(duì)多酚得率的影響.

由圖4可以看出，在料液比1∶30處多酚得率最大為1.42%.原因可能是當(dāng)料液比低時(shí)，水與多酚會(huì)有一個(gè)濃度差，可以加快多酚的溶解提取.隨著料液比的增加，溶劑增大濃度減小，濃度差會(huì)有一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，得率就會(huì)趨于平緩.因此，選擇料液比為1∶30較合適.

2.3.4提取溫度對(duì)多酚得率的影響

圖5為不同提取溫度對(duì)多酚得率的影響.

由圖5可知，最高點(diǎn)也是得率最大的點(diǎn)在70 ℃，得率為1.98%.在50 ℃～70 ℃，多酚得率曲線上升趨勢(shì)明顯.多酚得率升高的原因可能是在溫度較低時(shí)，對(duì)于提取物沒(méi)有達(dá)到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，多酚的溶解速度不高.在70 ℃后下降可能是因?yàn)槎喾拥慕鏊俣冗_(dá)到了一個(gè)平衡，溫度過(guò)高反而使酶蛋白受熱發(fā)生變性，減少了多酚的含量[26].選取提取溫度為70 ℃較合適.

2.3.5提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響

圖6為不同提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響.

由圖6可看出，隨著提取次數(shù)的增加，葛葉中多酚的得率越來(lái)越小.在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)葛葉多酚第1次的提取得率為1.81%，第2次提取時(shí)多酚得率急劇下降，為0.41%.原因是經(jīng)過(guò)2次提取葛葉中的多酚類化合物基本已浸出，為降低能耗以及避免多次提取造成多酚損失[27]，所以提取2次為宜， 2次提取多酚得率共為2.22%.

2.3.6單因素實(shí)驗(yàn)小結(jié)

實(shí)際上葛葉比葛根的多酚含量相對(duì)較少，但是經(jīng)過(guò)單因素?cái)?shù)據(jù)分析可以看出，采用提取時(shí)間2 h、提取pH值為4、料液比1∶30、提取次數(shù)2次時(shí)葛葉多酚提取條件最優(yōu)，在此條件下葛葉多酚得率可達(dá)2.22%.在此條件下葛葉的多酚含量相對(duì)較多，可用于后續(xù)抗氧化性檢測(cè).

2.4葛葉的抗氧化活性結(jié)果分析

2.4.1DPPH·清除能力測(cè)定結(jié)果

圖7為不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣液對(duì)DPPH·清除率的影響.

由圖7結(jié)果可知，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣液與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)DPPH·的清除率是隨著質(zhì)量濃度增加而增加.在質(zhì)量濃度小于1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率較為明顯，原因是樣液和沒(méi)食子酸一樣含有供氫體，可還原氧化性的自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，之后清除率變化開(kāi)始平緩沒(méi)有大幅度的變化，可能是試液中的有效物質(zhì)被氧化[8].

2.4.2清除羥基自由基·OH清除能力測(cè)定結(jié)果

圖8為不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣液對(duì)·OH清除率的影響.

由圖8結(jié)果可知，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)于羥基自由基的清除率變化相對(duì)于樣液來(lái)說(shuō)是相對(duì)平緩的，標(biāo)準(zhǔn)液在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)·OH清除能力基本不變，接近于直線.在低濃度時(shí)樣液的清除率較低，隨著濃度的增加曲線呈上升趨勢(shì)后逐漸平緩，可能是在反應(yīng)體系中樣液對(duì)羥基自由基的清除能力到達(dá)了一定數(shù)值，在質(zhì)量濃度為6 mg/mL處最大清除率為76.24%.

3結(jié)論

用福林酚法測(cè)定多酚含量，其質(zhì)量濃度范圍選取在0～4.4 μg/mL，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度與吸光值呈良好的線性關(guān)系.對(duì)葛葉多酚的提取進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)的提取多酚的條件為：提取時(shí)間2 h，提取pH值為4，料液比1∶30，提取次數(shù)2次，在此條件下提取葛葉多酚得率可達(dá)2.22%.對(duì)葛葉多酚提取液進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.27%;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.94%;加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.66%，證明該方法的準(zhǔn)確度良好，可應(yīng)用于葛葉多酚含量的測(cè)定.在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)葛葉多酚提取液對(duì)DPPH·和·OH的最大清除力分別為80.99%和76.24%，證明提取液具有較好的抗氧化性能.

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Extraction technology of polyphenols from Pueraria lobata leaf and its antioxidant properties

TANG Tingfan1，2， ZHU Jiaqing1，2， LI Rongbin1，2， FENG Jun1，2， HUANG Fangli1，2， LIANG Jieting1，2， TIAN Yuhong， LI Xiaohui1，2， CHENG Hao*1，2

（1.School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technoloy， Liuzhou 545006， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technoloy）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： The polyphenols in Pueraria lobata were extracted by reflux method， and the content ofpolyphenols in Pueraria lobata was determined by Folin phenol method. The applicability of? polyphenols in Pueraria lobata was verified by precision， stability and standard addition recovery tests and the antioxidant properties of polyphenols from Pueraria lobata were studied. The single factor experiment was used to study the effect on the yield of polyphenols from Pueraria lobata. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： solvent pH=4， solid-liquid ratio 1∶30， 70 ℃ water bath for 2.0 h， the relative standard error of precision test was 0.27%; the relative standard error of stability test was 0.94%; the relative standard error of recovery experiment was 1.66%; under these conditions， the yield of Pueraria leaf polyphenols was 2.22%. Polyphenols from Pueraria lobata had strong scavenging effect on DPPH· and ·OH， with the maximum scavenging rates of 80.99% and 76.24%， respectively. The process of extracting polyphenols from Pueraria lobata by?? reflux method is reasonable and simple， and the extracted polyphenols have strong antioxidant activity， providing basic research for the development and utilization of Pueraria lobata polyphenols.

Key words： leaves of Pueraria lobata; polyphenols; extraction technology; antioxidation

（責(zé)任編輯：黎?? 婭）

收稿日期：2020-09-14

基金項(xiàng)目：廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（GKYC202012）;國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21662003）;廣西壯族自治區(qū)中青年教師

基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（KY2016YB250）;廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金（GXTZY201901）;廣西科技大學(xué)博士基金項(xiàng)目

（?？撇?4Z06）資助 .

作者簡(jiǎn)介：唐婷范，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然產(chǎn)物化工.

通信作者：程昊，博士，副研究員，研究方向：應(yīng)用化學(xué)，E-mail：iamchenghao@126.com.