基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金葉拜毒顆?？剐鹿诓《镜淖饔脵C(jī)制

彭雙鳳 田鑫 王興

【摘 要】 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析金葉拜毒顆粒抗新型冠狀病毒的有效成分、靶點(diǎn)和通路，探討其抗新型冠狀病毒的機(jī)制，為中醫(yī)藥治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-2019）提供參考。方法：通過(guò)TCMSP、PubMed、Swiss Target Prediction等數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中篩選金葉拜毒顆粒方中中藥的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn);通過(guò)Genecards、OMIMS數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出新型冠狀病毒的疾病靶點(diǎn);使用 Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)和潛在靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，使用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò);通過(guò)Matescape富集分析預(yù)測(cè)核心模塊和作用機(jī)制。結(jié)果：挖掘出金葉拜毒顆粒中化合物46個(gè)，465個(gè)藥物靶點(diǎn)，COVID-19相關(guān)疾病靶點(diǎn)465個(gè)，二者交集靶點(diǎn)71個(gè)，組方中主要化學(xué)成分23個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及GAPDH、ALB、TNF、TP53、MAPK3、IL6、MAPK1、CASP3、MAPK8、FOS等，預(yù)測(cè)到4個(gè)核心板塊。GO富集分析共得到1665個(gè)條目，KEGG通路富集篩選出條149信號(hào)通路。結(jié)論：金葉拜毒顆粒具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用于新型冠狀病毒。

【關(guān)鍵詞】 金葉拜毒顆粒;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);新型冠狀病毒肺炎;免疫和炎癥反應(yīng)

Abstract：Objective To analyze the effective components and target pathway of Jinye Baidu granule against novel coronavirus by means of network pharmacology， and to explore its mechanism of anti-novel coronavirus， so as to provide reference for the treatment of COVID-19 （COVID-2019） with traditional Chinese medicine.Methods The chemical constituents and action targets of Jinyebaidu granule were screened by TCMSP， PubMed， Swiss Target Prediction and related literatures， and the disease targets of novel coronavirus were screened by Genecards and OMIMS databases. The interaction relationship between drug-component-target-disease network and potential targets was constructed by Cytoscape3.7.2 software， the protein interaction network was drawn by String database and Cytoscape3.7.2 software， and the core modules and action mechanism were predicted by Matescape enrichment analysis.Results 46 compounds， 465 drug targets， 465 disease targets related to covid-19， 71 intersection targets and 23 main chemical components were found in Jinyebaidu granules. The key targets involved GAPDH， ALB， TNF， TP53， mapk3， IL6， mapk1， CASP3， mapk8， Fos and so on.A total of 1665 entries were obtained by go enrichment analysis， and 149 signal pathways were screened by KEGG pathway enrichment. Conclusion The novel coronavirus has many components， multiple targets and multipathways.

Keywords：Jinye Baidu Granule; Network Pharmacology; COVID-19; Immune and Inflammatory Reaction

2019年12月份以來(lái)，新型冠狀病毒迅速蔓延，輕度患者出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸困難、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙等[1]。

在本次抗新型冠狀病毒肺炎的過(guò)程中，同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員相繼選用金葉拜毒顆粒作為新型冠狀病毒肺炎的預(yù)防方，并取得較佳的防治療效。因此金葉拜毒顆粒被作為一般患者隔離期的推薦用藥，被載入《同濟(jì)醫(yī)院關(guān)于新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)診療方案及預(yù)防方案》，并得到了湖北省衛(wèi)健委的肯定，金葉敗毒顆粒也被列入新冠肺炎的防控藥品之一[2]。

故本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析金葉拜毒顆粒中藥物化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，預(yù)測(cè)金葉拜毒顆粒治療新型冠狀病毒肺炎的潛在機(jī)制，為中醫(yī)藥治療新型冠狀病毒肺炎提供一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法及結(jié)果

1.1 篩選金葉拜毒顆粒潛在活性化合物 在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，以金葉拜毒顆粒組成藥物：金銀花、大青葉、魚(yú)腥草為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，篩選后得到每味藥材的有效成分。檢索已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，收集蒲公英的有效成分和化合物。得到金葉拜毒顆粒主要活性化合物共23個(gè)，其中金銀花14個(gè)，大青葉6個(gè)，魚(yú)腥草2個(gè)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道蒲公英收集其主要化合物6個(gè)。

1.2 篩選金葉拜毒顆粒作用靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)上述篩選出的金銀花、大青葉、魚(yú)腥草3味有效成分預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)得到蒲公英的主要化合物，在PubMed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）搜索其化合物名稱得到CAS號(hào)，下載其分子結(jié)構(gòu)圖，前往Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetp rediction.ch/）進(jìn)行蒲公英靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。得到作用靶點(diǎn)：金銀花449個(gè)，大青葉83個(gè)，魚(yú)腥草195個(gè)，蒲公英600個(gè)，去重后，共得到藥物靶點(diǎn)465個(gè)。

1.3 獲取疾病靶點(diǎn) 基于GeneCard（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org）和“Corona Virus Disease 2019、CoronaVirus”為關(guān)鍵詞，選擇物種為Homosapiens，檢索得到COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)465個(gè)。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)的獲取 利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢金葉拜毒顆?？赡艿淖饔冒悬c(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，規(guī)范靶點(diǎn)蛋白。在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）分別錄入金葉拜毒顆粒和新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)基因，繪制韋恩圖（圖1），兩者取交集后獲得共同靶點(diǎn)71個(gè)。

1.5 金葉拜毒顆?；瘜W(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立 將藥物的化學(xué)成分，以及“1.4”所得的潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，使用Network Analyzer 功能對(duì)藥物中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2），其中金葉拜毒顆粒中有23個(gè)有效成分對(duì)新型冠狀肺炎具有調(diào)節(jié)作用。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征進(jìn)行核心節(jié)點(diǎn)的篩選，Degree表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，成分的Degree值越大說(shuō)明該成分越重要，在與潛在靶點(diǎn)相互作用的化學(xué)成分中，Degree>8（2倍中位數(shù)）的化學(xué)成分有9種，Degree值從大到小分別為：槲皮素（quercetin，Degree=102）、山奈酚（kaempferol，Degree=39）、木犀草素（luteolin，Degree=33）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，Degree=18）、蒲公英黃銅（3′-hydroxy flavanone，Degree=17）、蒲公英賽酮（Taraxerone，Degree=12）、靛玉紅（indirubin，Degree=11）、綠原酸（Heriguard，Degree=11）、乙酰蒲公英萜醇（Taraxerol Acetate，Degree=11）。表明這9種化學(xué)成分可能是金葉拜毒顆粒干預(yù)COVID-19的主要中藥成分。因潛在作用靶點(diǎn)與各成分關(guān)聯(lián)較緊密，故以Degree值的2倍中位數(shù)（8）作為主要潛在靶點(diǎn)篩選的閾值，經(jīng)篩選得到主要潛在靶點(diǎn)有9個(gè)，分別為：PTGS2、PTGS1、PPARG、PIK3CG、ACHE、NOS3、NOS2、CASP3、BCL2。上述一種成分與多個(gè)靶點(diǎn)作用，多種成分又可共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了金葉拜毒顆粒多成分、多靶點(diǎn)的綜合干預(yù)特點(diǎn)。

1.6 構(gòu)建金葉拜毒顆粒PPI網(wǎng)絡(luò)圖 在STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入71個(gè)潛在靶點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息，使用Cytoscape3.7.2軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征進(jìn)行核心節(jié)點(diǎn)的篩選，Degree>27（中位數(shù)）的有GAPDH、ALB、TNF、TP53、MAPK3、IL6等31個(gè)靶點(diǎn)，與“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中的靶點(diǎn)相互映射，得到PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3等5個(gè)核心潛在靶點(diǎn)，推測(cè)金葉拜毒顆粒的有效成分可能通過(guò)作用于上述5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)而干預(yù)COVID-19。

為了進(jìn)一步探討這些潛在靶點(diǎn)之間相互作用的生物過(guò)程，運(yùn)用Metascape（https：//metascape.org/）以MCODE算法識(shí)別靶點(diǎn)之間最密切的生物過(guò)程，收集P <0.01，最小計(jì)數(shù)為3和富集因子> 1.5的術(shù)語(yǔ)，并根據(jù)其成分靶點(diǎn)之間相互關(guān)系的密切程度得到前4個(gè)具有豐富生物過(guò)程的核心富集模塊（圖4A-4D），進(jìn)行富集分析后按P值劃分，選取4個(gè)最佳功能描述（表1），圖4A核心富集模塊主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、American trypanosomiasis，Hepatitis B，圖4B核心富集模塊主要涉及HepatitisB、Pathways in cancer， Toll-like receptor signaling pathway，圖4C核心富集模塊主要涉及Toll-like receptor signaling pathway，IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway，圖4D核心富集模塊主要涉及Pathways in cancer、Hepatitis B、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications。

1.7 GO和KEGG富集分析 為探討上述71個(gè)交集靶點(diǎn)在防疫COVID-19時(shí)的作用機(jī)制，運(yùn)用Metascape3.7.2對(duì)71個(gè)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并按相似度（Kappa）分?jǐn)?shù)> 0.3對(duì)生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分層聚類，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)聚類，選擇集群中關(guān)系最密切的前20個(gè)生物學(xué)術(shù)語(yǔ)作為代表集群的術(shù)語(yǔ)，各集群按互相關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)大小與屬于集群的輸入基因數(shù)量成正比，連線越粗，代表關(guān)系越密切。

GO分析得到1665條生物學(xué)過(guò)程（圖5A-5B），KEGG分析得到149條通路途徑（圖6A-6B），均取結(jié)果前20條通路作為重點(diǎn)通路進(jìn)行展示。按P值大小選擇前20種生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行描述，主要涉及的GO生物過(guò)程有：response to lipopolysaccharide、cytokine-mediated signaling pathway、response to oxidative stress、apoptotic signaling pathway、positive regulation of cytokine production等。主要涉及的KEGG生物過(guò)程有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Apoptosis、HIF-1 signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis等。

2 討論

在2003年“非典”期間，同濟(jì)醫(yī)院推薦使用金葉拜毒顆粒作為抗SARS病毒的預(yù)防和治療，并取得了顯著的效果，得到廣大醫(yī)務(wù)人員和患者的信賴。在本次抗疫情中，武漢同濟(jì)醫(yī)院再次推薦使用金葉拜毒顆粒作為新型冠狀病毒肺炎的防治方。金葉拜毒顆粒前身為同濟(jì)醫(yī)院研發(fā)的“抗炎6號(hào)”注射劑，源自《醫(yī)宗金鑒》古方“五味消毒飲”，主要方藥由金銀花、大青葉、魚(yú)腥草、蒲公英4味藥組成，臨床上主要治療風(fēng)溫肺熱在衛(wèi)證。其中金銀花性寒味甘，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，既能疏風(fēng)溫在表之邪熱，又能解熱入氣分、血分之熱毒，是常用的清熱解毒中藥之一，是為君藥;大青葉、魚(yú)腥草、蒲公英三者共為臣藥，三者共效增強(qiáng)清熱解毒之功。其中金銀花與大青葉合用，前者偏于疏散風(fēng)熱，后者擅長(zhǎng)涼血消斑;金銀花與魚(yú)腥草相須使用，前者擅于清熱解毒，后者偏于消癰排膿;金銀花與蒲公英配伍使用，前者適偏于輕宣疏散，后者偏于消腫散結(jié)。全方配伍，共奏清熱解毒、疏散外邪之功。

2.1 多成分-多靶點(diǎn)-多通路調(diào)控 “免疫-炎癥反應(yīng)”干預(yù)COVID-19當(dāng)病毒侵入機(jī)體，機(jī)體在受到病毒感染后會(huì)激發(fā)自身保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而吞噬和隔離病毒，但是失調(diào)的、過(guò)度的免疫反應(yīng)會(huì)引起免疫激化，從而引起患者體內(nèi)炎癥因子過(guò)度表達(dá)而出現(xiàn)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[7-9]。細(xì)胞因子風(fēng)暴可對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損害，如透明膜形成、彌漫性肺泡損傷、纖維蛋白滲出等，進(jìn)而加速肺損傷，而嚴(yán)重的肺損傷以及循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)進(jìn)一步引起全身多器官功能障礙及損傷[10]。目前認(rèn)為，重癥肺炎產(chǎn)生的原因往往并非是病毒本身，而是感染誘發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生過(guò)度的免疫應(yīng)答，體內(nèi)失衡的細(xì)胞因子系統(tǒng)是造成肺炎及急性肺損傷的一個(gè)重要的原因[11]。因此，除了抗病毒治療外，對(duì) COVID-19免疫炎癥治療策略就顯得尤為重要[12]。

本研究共篩選得到金葉拜毒顆粒防治疾病的9個(gè)核心潛在化學(xué)成分，分別為槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、蒲公英黃銅、蒲公英賽酮、靛玉紅、綠原酸、乙酰蒲公英萜醇。

吳莎等[13]發(fā)現(xiàn)槲皮素及穿心蓮內(nèi)酯均能對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的甲型流感病毒H1N1，登革病毒 2 型，柯薩奇 B 病毒以及呼吸道合胞病毒起一定的抑制作用。此外槲皮素可以使用基于偽病毒的藥物篩選系統(tǒng)抑制H5N1病毒的進(jìn)入[14]。Zhang R等[15]發(fā)現(xiàn)，山奈酚通過(guò)抑制TLR4/MyD88介導(dǎo)NF-kB和MAPKs途徑對(duì)H9N2病毒誘導(dǎo)的炎癥表現(xiàn)出保護(hù)作用，并且山奈酚被認(rèn)為是潛在治療流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷的有效藥物。Wu S等[16]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以劑量依賴性減少病毒后代的產(chǎn)生以及CVB3 RNA和蛋白質(zhì)的合成，發(fā)現(xiàn)木犀草素介導(dǎo)的CNB3抑制在機(jī)械上是可能的，至少部分是通過(guò)抑制p38 MAPK和JNK MAPK的磷酸化，并抑制NF-kB核易位并隨后減弱CVB3（科薩奇病毒B3）感染細(xì)胞中的炎性細(xì)胞的表達(dá)。Li H等[17]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可有效防止由肺炎鏈球素引起的細(xì)胞裂解，使小鼠免受肺炎鏈球菌感染。侯京玲等[18]發(fā)現(xiàn)蒲公英黃酮對(duì)小鼠耳廓、足趾腫脹及大鼠棉球肉芽腫有明顯抑制作用，結(jié)果表明蒲公英黃銅對(duì)急慢性炎癥具有良好的抑制作用，高劑量的蒲公英黃酮抗炎效果最佳?，F(xiàn)代研究顯示蒲公英賽酮可抑制 LPS （脂多糖）誘導(dǎo)的多種炎癥介質(zhì)的釋放[19]。賴金輪等[20]研究顯示靛玉紅對(duì)許多炎癥性疾病都有抑制作用，推測(cè)其機(jī)理與抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及相關(guān)介質(zhì)的釋放、乃至對(duì)上皮細(xì)胞的修復(fù)的出色表現(xiàn)，預(yù)期靛玉紅在炎性疾病的防治上或?qū)缪菰絹?lái)越重要的角色?？咕ЬУ萚21]發(fā)現(xiàn)綠原酸在小鼠體內(nèi)體外均能有效降低脂多糖誘導(dǎo)的COX-2的蛋白表達(dá)，并能促進(jìn) COX-2蛋白的降解.降低脂多糖誘導(dǎo)的COX-2的蛋白水平是綠原酸抗炎的機(jī)制之一。Yao等[22]研究表明乙酰蒲公英萜醇通過(guò)干擾TAK1和AKt的激活來(lái)下調(diào)巨噬細(xì)胞中促炎性介質(zhì)的表達(dá)，從而阻止NF-kB的激活。

中化學(xué)成分靶點(diǎn)與COVID-19有71個(gè)共同靶點(diǎn)，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析與“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”相映射發(fā)現(xiàn)本方中化學(xué)成分主要可能通過(guò)調(diào)控PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3這5個(gè)核心靶點(diǎn)干預(yù)COVID-19。

前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶（prostaglandin endoperoxidesynthase，PTGS），又稱環(huán)氧合酶 （cyclooxygenase，COX），是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素的關(guān)鍵限速酶[23]。在人體內(nèi)，PTGS 主要存在兩種亞型：結(jié)構(gòu)型 PTGS1 和誘導(dǎo)型 PTGS2。前者表達(dá)于所有組織細(xì)胞，參與機(jī)體正常的生理功能;后者是一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，在正常狀態(tài)下低表達(dá)或不表達(dá)，但可在炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、促 癌 劑、激素等多種體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下表達(dá)[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450（CYPs）/環(huán)氧合酶2（COX-2）途徑中花生四烯酸代謝失調(diào)是導(dǎo)致脂多糖（LPS）異常的主要原因[26]。急性肺損傷（ALI）中炎癥反應(yīng)不受控制，COX-2和可溶性環(huán)氧化合物水解酶（sEH）雙重抑制PTUPB通過(guò)抑制NLRP3炎性體的激活，在治療急性肺損傷中發(fā)揮抗炎作用。PPARG屬于核受體過(guò)氧化物酶體增生激活受體（PPAR）亞家族的成員，該基因編碼的蛋白質(zhì)是PPAR-γ， PPAR-γ參與了免疫、炎癥等細(xì)胞過(guò)程[27]，包括脂肪細(xì)胞的分化、炎癥反應(yīng)、凋亡、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化及癌癥等。NOS2（誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、eNOS）和NOS3（內(nèi)皮型一氧化氮合酶、iNOS）是一組同工酶，反應(yīng)產(chǎn)生的一氧化氮 （NO） 是生物體細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的重要信號(hào)分子， 能調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，參與炎癥反應(yīng)、心血管、外周、中樞神經(jīng)以及免疫等系統(tǒng)生理過(guò)程和生物信號(hào)的調(diào)節(jié)[28]。半胱氨酸蛋白酶2（CASP3）是屬于半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，是細(xì)胞凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游重要的效應(yīng)因子[29]。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，其主要表現(xiàn)為線粒體膜損傷，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞外，激活CASP3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。

在對(duì)金葉拜毒顆粒作用靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行GO、KEGG富集分析以及核心模塊分析發(fā)現(xiàn)，富集的疾病主要為類似SARS-CoV-2感染的感染性疾病，主要包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的感染，例如Hepatitis B 、Chagas disease、Amoebiasis、Herpes simplex infection、HTLV-I infection、Prion diseases。對(duì)應(yīng)的通路主要富集在免疫和炎癥相關(guān)通路中，例如HIF-1 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Chemokine signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、p53 signaling pathway。

2.2 金葉拜毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)“HIF-1信號(hào)通路”干預(yù)COVID-19 HIF-1信號(hào)通路是調(diào)解機(jī)體缺氧的重要通路，金葉拜毒顆粒中涉及的靶點(diǎn)有BCL2、EGFR、GAPDH、HMOX1、IFNG、IL6、NOS2等，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺氧相關(guān)反應(yīng)時(shí)，機(jī)體會(huì)形成以HIF-1為核心，聯(lián)合其上下游基因及產(chǎn)物組成復(fù)雜的缺氧調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)參與某些通路信號(hào)、調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等途徑，使缺氧的細(xì)胞和組織能保持氧穩(wěn)定及耐受低氧狀態(tài)[31]。COVID-19組織學(xué)檢查顯示雙側(cè)彌漫性肺泡損傷伴細(xì)胞纖維黏液樣滲出物，肺細(xì)胞脫落、肺水腫及透明膜形成，兩肺可見(jiàn)以淋巴細(xì)胞為主的間質(zhì)單核炎性浸潤(rùn)[32]。不典型肺細(xì)胞增大的多核合胞體細(xì)胞肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大核、雙親顆粒狀細(xì)胞質(zhì)和明顯核仁，呈病毒性細(xì)胞病變樣改變。臨床則表現(xiàn)為進(jìn)行性的呼吸困難，呼吸窘迫綜合征，最終死于呼吸衰竭[33]。因此，金葉拜毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控HIF-1信號(hào)通路，有助于改善COVID-19患者臨床缺氧癥狀。

2.3 金葉拜毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)“IL-17 信號(hào)通路”干預(yù)COVID-19 在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)，金葉拜毒顆粒除了參與圖6中的生物學(xué)過(guò)程，還參與了IL-17信號(hào)通路，Log10（P）= -27.80，Log10（q）=-25.71，參與的靶點(diǎn)主要有CASP3、CASP8、MAPK14、FOS、CXCL2、IFNG、IL6等。IL-17 信號(hào)通路是在宿主免疫學(xué)中起關(guān)鍵作用的通路，在細(xì)胞增殖分化、生物因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用， 與腫瘤、器官移植、感染及多種炎癥過(guò)程密切相關(guān)[34]。在呼吸系統(tǒng)中，IL-17 作為聯(lián)系T細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的重要介質(zhì)， 通過(guò)刺激支氣管上皮細(xì)胞 、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成 、釋放 IL-8，GCP-2， MIP-2 與粘附因子等生物因子參與炎癥狀態(tài)下中性粒細(xì)胞在氣道的募集[35]。另外，IL-17 還刺激支氣管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成 、釋放中性粒細(xì)胞活化因子 IL-6，并增強(qiáng) MPO 和彈性蛋白酶活性[36]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）》[37]中首次提出，對(duì)于雙肺廣泛病變及重型COVID-19患 者，如 實(shí) 驗(yàn) 室 檢 測(cè) 白 細(xì) 胞 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）升高者，可試用托珠單抗治療。推測(cè)托珠單抗有可能通過(guò)阻斷“炎癥風(fēng)暴”進(jìn)而阻止輕癥COVID-19患者向重癥或危重癥患者轉(zhuǎn)變，從而降低病死率[38]。因此，可能推測(cè)金葉拜毒顆粒可能通過(guò)“IL-17 信號(hào)通路”調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6的釋放從而阻斷“炎癥風(fēng)暴”達(dá)到干預(yù)COVID-19的效果。

2.4 金葉拜毒顆粒可能通過(guò)“EVGF 信號(hào)通路”干預(yù)COVID-19 金葉拜毒顆粒除了參與圖6中的生物學(xué)過(guò)程，還參與了EVGF信號(hào)通路，Log10（P）= -16.80，Log10（q）= -15.45，參與的靶點(diǎn)主要有MAPK14、HSPB1、NOS3、PIK3R1等。VEGF 信號(hào)通路參與到血管新生整個(gè)過(guò)程，發(fā)揮了不可或缺的作用。VEGF及其受體廣泛分布在肺部，不僅存在于肺泡上皮細(xì)胞，而且在血管、氣道平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等都有VEGF及其受體的表達(dá)[39]。SARS-CoV-2主要通過(guò) 2 型肺泡上皮細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ angiotensin-converting enzyme 2，ACE2） 首先感染肺，其最常見(jiàn)的致命并發(fā)癥是急性呼吸窘迫綜合征（ acute respiratory distress syndrome， ARDS ）[40]。ARDS以肺泡上皮損傷和毛細(xì)血管通透性增加所致彌漫性肺泡肺水腫及透明膜的形成為主要病理特征，以呼吸窘迫和嚴(yán)重低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其重要環(huán)節(jié)之一[41]。Gullen等[42]研究提示，VEGF作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞使肌動(dòng)蛋自發(fā)生排列改變，細(xì)胞間隙形成，血管內(nèi)皮通透性增加并導(dǎo)致肺水腫和肺泡內(nèi)蛋白含量增高。陳思峰等[43]認(rèn)為肺泡上皮屏障和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障通透性增高引起肺水腫，肺泡上皮屏障通透性增加不是 SARS-CoV-2 引起的ARDS的唯一主要機(jī)制，我們應(yīng)該對(duì)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障的破壞引起足夠的重視。因此，推斷金葉拜毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)“EVGF”信通路減少“炎癥風(fēng)暴”對(duì)肺血管上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮通透性從而干預(yù)COVID-2019。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)金葉拜毒顆粒防治COVID-19進(jìn)行探索性研究，槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、蒲公英黃銅、蒲公英賽酮、靛玉紅、綠原酸、乙酰蒲公英萜醇這些化學(xué)成分作用于PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3等靶點(diǎn)，參與細(xì)胞分化、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等途徑，進(jìn)而調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)等相關(guān)通路、HIF-1信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路和EVGF信號(hào)通路。

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