VSIG4在乳腺癌中的表達(dá)及其與免疫浸潤和 預(yù)后的相關(guān)性

宋文靜，劉姝婷，賀鑫，龔鵬舉，楊燕，魏蕾，張京偉

0 引言

乳腺癌（breast cancer,BC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)預(yù)計，2020年美國的乳腺癌女性患者將占所有女性癌癥患者的30%（276 480）和癌癥死亡人數(shù)的15%（42 170）[1]。然而，仍然缺乏有用的乳腺癌免疫治療生物標(biāo)志物。因此，急需識別和轉(zhuǎn)化乳腺癌新的免疫相關(guān)分子標(biāo)志物和治療靶點。

腫瘤與人體免疫系統(tǒng)之間的相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和診療中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）由腫瘤細(xì)胞及其周圍基質(zhì)和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（tumor infiltrating immune cells,TIICs）組成[2]。研究表明高浸潤豐度的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAM）與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，大多數(shù)TAM表達(dá)為M2表型。關(guān)于機(jī)制研究，有研究表明TLR2/NOX2/自噬軸、Wnt/β-catenin信號通路等可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，增強(qiáng)腫瘤的惡性行為[3-4]。V-set包含免疫球蛋白域4（V-set and immunoglobulin domain containing 4,VSIG）是M2型巨噬細(xì)胞的免疫標(biāo)記基因[5]，并且，VSIG4表達(dá)水平與卵巢癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的預(yù)后相關(guān)[6-9]，但關(guān)于VSIG4在乳腺癌中的研究目前仍較少。

本研究通過CIBERSORT（https://cibersort.stanford.edu/）計算乳腺癌樣本中TIICs的浸潤豐度，通過建立乳腺癌風(fēng)險模型，從多方面分析M2型巨噬細(xì)胞與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)性。并進(jìn)一步通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析VSIG4的表達(dá)水平與多種信號通路之間的相關(guān)性，并預(yù)測VSIG4的上游調(diào)控miRNA，探索VSIG4與乳腺癌腫瘤免疫之間的潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 患者數(shù)據(jù)獲取

從TCGA下載乳腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)（經(jīng)過FPKM標(biāo)準(zhǔn)化）和臨床資料（包括年齡、生存時間、生存狀態(tài)、T、N、M、病理分期、ER、PR、HER2狀態(tài)），包括1 109例乳腺癌腫瘤標(biāo)本和113例乳腺癌癌旁組織標(biāo)本。

1.2 腫瘤免疫分析

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)，利用“Cibersort”R包來估計單樣本中22種免疫細(xì)胞的豐度。通過腫瘤免疫估計資源（tumor immune estimation resources,TIMER）[10]中的“Differential Expression”模塊分析VSIG4在癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，利用“Correlation”模塊分析M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度與VSIG4表達(dá)水平的相關(guān)性，“Survival”模塊分析M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度對乳腺癌預(yù)后的影響。通過TISIDB[11]腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用在線網(wǎng)站中“l(fā)ymphocyte”模塊分析乳腺癌中VSIG4表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性。

1.3 預(yù)后影響因素篩選與鑒定

納入年齡、PR、ER、HER2及T、N、M、病理分期等臨床病理特征及免疫細(xì)胞浸潤豐度進(jìn)行單因素邏輯回歸分析，篩選有顯著統(tǒng)計學(xué)意義的變量確定為預(yù)后相關(guān)的影響因素。進(jìn)一步對上述影響因素進(jìn)行Lasso回歸分析，并且建立預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型，計算所有乳腺癌患者的風(fēng)險評分。繪制生存狀態(tài)圖及風(fēng)險熱圖，并根據(jù)風(fēng)險評分繪制生存曲線，通過接收者工作特征曲線（receiver operating characteristic,ROC）下面積（area under the curve,AUC）量化該模型的預(yù)測性能。

1.4 GEPIA網(wǎng)站分析

基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）[12]包含來自TCGA和GTEx的樣本的RNA測序數(shù)據(jù)。通過“Expression”模塊可視化乳腺癌與癌旁組織中VSIG4表達(dá)水平，“Survival”模塊評估VSIG4對乳腺癌患者總生存期的影響，Log rank檢驗計算GEPIA生存分析的顯著性。

1.5 通路富集分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫[13-14]分析構(gòu)建VSIG4的PPI，并通過Cytoscape（version 3.7.2）進(jìn)行可視化。為闡明VSIG4與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中信號通路的關(guān)系，使用GSEA（version 4.0.1）[15]進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）的富集分析。

1.6 VSIG4上游調(diào)控miRNA篩選與生存分析

通過Starbase網(wǎng)站的miRmap、miRanda、PITA三種miRNA靶標(biāo)預(yù)測工具預(yù)測VSIG4上游調(diào)控miRNA。通過Kaplan-Meier在線網(wǎng)站分析miRNA在METABRIC和TCGA兩個數(shù)據(jù)庫中與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，Log rank檢驗計算結(jié)果的顯著性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時，連續(xù)變量的均值和中位數(shù)采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行比較，若為非正態(tài)數(shù)據(jù)，則采用Mann-Whitney U檢驗?；虮磉_(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌與癌旁組織中免疫細(xì)胞浸潤豐度比較

結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，乳腺癌組織中巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、Tregs的浸潤程度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中，M2型巨噬細(xì)胞在乳腺癌樣本中整體浸潤豐度較高，且較正常樣本低（P＜0.001），見圖1。

圖1 癌與癌旁組織中免疫細(xì)胞浸潤豐度比較Figure 1 Comparison of infiltration abundance of immune cells in carcinoma and adjacent tissues

2.2 預(yù)后影響因素的篩選與鑒定

單因素回歸分析結(jié)果顯示：年齡、N、M、病理分期、PR狀態(tài)及M2型巨噬細(xì)胞的浸潤豐度與乳腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05），見圖2A。進(jìn)一步對上述因素進(jìn)行Lasso回歸分析，共篩選出年齡、病理分期（pathological stage）、PR狀態(tài)和M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度4個預(yù)后影響因素（P＜0.05）建立預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型，并計算所有乳腺癌患者的風(fēng)險評分。高風(fēng)險組患者的生存時間較低風(fēng)險組顯著縮短（P＜0.001），見圖2B。高風(fēng)險組患者年齡更大、分期更晚、PR陽性率較低、M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度更高（P＜0.05），見圖2C。與低風(fēng)險組相比，截止到隨訪時間，高風(fēng)險組有更多患者死亡，乳腺癌患者的生存狀態(tài)和風(fēng)險評分分布見圖2D～E?；谠撃Ｐ蛯θ橄侔┗颊叩念A(yù)后進(jìn)行預(yù)測，展示了模型較好的預(yù)測能力（AUC=0.816,P＜0.05），見圖2F。

圖2 預(yù)后影響因素的篩選與鑒定Figure 2 Screening and identification of prognostic factors

2.3 M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

去除低浸潤豐度的樣本后，共有778個腫瘤樣本和113個癌旁樣本。箱型圖顯示，腫瘤樣本中M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度比正常樣本中顯著降低，值得注意的是，腫瘤樣本中，T、N、M、病理分期越高，M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度越高，見圖3A～D。同時圖3E的生存曲線也表明，M2型巨噬細(xì)胞的浸潤豐度與乳腺癌預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)（HR=1.35,P＜0.05）。

圖3 M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Figure 3 Relation between infiltration abundance of macrophage M2 and prognosis of breast cancer patients

2.4 巨噬細(xì)胞免疫標(biāo)記基因VSIG4的泛癌表達(dá)譜

TIMER和TISIDB分析結(jié)果顯示：M2型巨噬細(xì)胞與其免疫標(biāo)記基因VSIG4具有較強(qiáng)的相關(guān)性（TIMER:r=0.634,P＜0.001;TISIDB:r=0.667,P＜0.001），并且，VSIG4表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤純度顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.342,P＜0.001），見圖4A～B。VSIG4在癌與癌旁的泛癌表達(dá)，與正常組織相比，VSIG4在膀胱癌、乳腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、腎嫌色細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、直腸癌、皮膚黑色素瘤中表達(dá)顯著較低（P＜0.05），在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭細(xì)胞癌、甲狀腺癌中表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖4C。VSIG4在乳腺癌與癌旁組織中的表達(dá)水平差異見圖4D（P＜0.001）。

圖4 M2型巨噬細(xì)胞免疫標(biāo)記基因VSIG4的泛癌表達(dá)譜Figure 4 Pan-carcinoma expression profile of macrophage M2 immune marker gene VSIG4

2.5 VSIG4與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

預(yù)后分析結(jié)果顯示，腫瘤樣本中VSIG4表達(dá)水平較正常樣本中顯著降低，值得注意的是，腫瘤樣本中，T、N、M、病理分期越高，VSIG4表達(dá)水平越高，見圖5A～D。同時圖5E的生存曲線也表明，VSIG4表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)（HR=1.4,P=0.039）。VSIG4表達(dá)水平和M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度聯(lián)合生存分析結(jié)果顯示，當(dāng)VSIG4高表達(dá)時，M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度越高，患者預(yù)后越差（HR=2.78,P＜0.001）；而當(dāng)VSIG4低表達(dá)時，M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度對預(yù)后無顯著影響（HR=1.21,P=0.378），見圖5E～F。

圖5 VSIG4與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Figure 5 Relation between expression level of VSIG4 and prognosis of breast cancer patients

2.6 VSIG4相關(guān)的信號通路富集分析

通路分析顯示VSIG4與細(xì)胞胞吞、細(xì)胞因子的生成和釋放、RNA剪接與甲基轉(zhuǎn)移、不飽和脂肪酸合成、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞黏附等通路顯著相關(guān)（P＜0.05），見圖6A～B。與VSIG4具有顯著相關(guān)性的基因見圖6C，圖中連接線的寬度反映了基因間的相關(guān)系數(shù)，紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。

圖6 VSIG4相關(guān)的信號通路富集分析Figure 6 Enrichment analysis of VSIG4-related signal pathways

2.7 VSIG4上游調(diào)控miRNA篩選與生存分析

維恩圖顯示miRmap、miRanda、PITA這3種預(yù)測工具共預(yù)測出4個miRNA（miR-29a、miR-29b、miR-29c，miR-185）可調(diào)控VSIG4的表達(dá)，見圖7A。生存分析結(jié)果顯示，在TCGA和METABRIC數(shù)據(jù)庫中miR-29a對乳腺癌患者預(yù)后有顯著影響（TCGA:HR=0.72,Log rankP=0.049；METABRIC:HR=0.65,Log rankP＜0.001），見圖7B～C。

圖7 VSIG4上游miRNA的篩選與生存分析Figure 7 Screening and survival analysis of upstream miRNA of VSIG4

3 討論

巨噬細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)中最豐富的細(xì)胞，具有較強(qiáng)的可塑性，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮多種功能。其中，M1型巨噬細(xì)胞具有殺死和清除腫瘤細(xì)胞的能力，而M2型巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出抗炎和促腫瘤作用[16]。M2型巨噬細(xì)胞可從多途徑直接影響腫瘤發(fā)展，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分解基底膜、促進(jìn)血管生成來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性和免疫抑制[17-19]。已有臨床研究與基礎(chǔ)實驗證實，M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)胃癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的侵襲和遷移[20-23]，但在比較癌與癌旁免疫細(xì)胞浸潤豐度時，M2型浸潤細(xì)胞在癌旁組織中相對富集[24]。本文基于TCGA-BRCA中RNA-seq數(shù)據(jù)計算得到免疫細(xì)胞浸

潤豐度，比較發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞在乳腺癌癌旁樣本中浸潤豐度較大，與早期乳腺癌相比，晚期乳腺癌中M2型巨噬細(xì)胞較富集。分析結(jié)果與既往研究一致，豐富了對于乳腺癌多樣本分析的研究結(jié)果。

通過查閱文獻(xiàn)和相關(guān)性分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)VSIG4可作為M2型巨噬細(xì)胞的免疫標(biāo)記基因之一。Byun等通過分析卵巢癌患者血液及組織中VSIG4的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與良性腫瘤相比，VSIG4在卵巢癌中過表達(dá)，同時可溶性VSIG4水平與卵巢癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)相關(guān)[6]。另外，有研究通過小鼠實驗和TCGA-PRAD數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在植入前列腺癌細(xì)胞后，老年小鼠較年輕小鼠前列腺中TAM的數(shù)量增加，老年前列腺癌患者體內(nèi)VSIG4表達(dá)水平更高，且與更高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率相關(guān)[8]。我們從基因水平深入分析VSIG4在乳腺癌中的生存情況及與乳腺癌分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，與早期乳腺癌相比，VSIG4在晚期乳腺癌中表達(dá)水平更高（StageⅠ-Ⅱ:2.476;StageⅢ:2.483;StageⅣ:2.548），提示患者預(yù)后不良。為了進(jìn)一步探索VSIG4調(diào)控乳腺癌進(jìn)展的機(jī)制，GSEA分析結(jié)果提示VSIG4可能參與細(xì)胞因子的生成與釋放、Toll樣受體及細(xì)胞黏附等信號通路，從而發(fā)揮其抗炎和促癌作用。

基因表達(dá)水平的變化與腫瘤的形成、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已證實成熟的miRNA可誘導(dǎo)下游靶基因的翻譯后抑制或mRNA降解[25-27]。據(jù)估計，人類中所有蛋白質(zhì)編碼基因中超過30%受miRNA調(diào)控，這表明miRNA可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的最常見因子[28-31]。miRNA對巨噬細(xì)胞分化、功能性極化和細(xì)胞間信息交流具有調(diào)控作用[32]，為探索VSIG4上游調(diào)控機(jī)制，我們利用3種工具預(yù)測VSIG4上游調(diào)控miRNA，通過生存分析進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p對VSIG4調(diào)控作用的可信度最高，且對乳腺癌的預(yù)后有顯著影響。既往研究表明，miR-29a-3p在多種癌癥中顯示出抑癌作用，如喉鱗癌、胃癌、肝癌等[33-34]，其中，Nie等通過相關(guān)性分析構(gòu)建了miR-29a-3p-COL1A2軸，并發(fā)現(xiàn)COL1A2的表達(dá)水平與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和M2型巨噬細(xì)胞浸潤豐度正相關(guān)，而與M1型巨噬細(xì)胞非正相關(guān)[35]。本研究通過生物信息學(xué)分析及預(yù)測猜想miR-29a可通過抑制VSIG4的表達(dá)發(fā)揮其促癌作用，但需要進(jìn)一步的細(xì)胞和動物實驗來進(jìn)行研究和驗證。

綜上所述，M2型巨噬細(xì)胞的浸潤豐度及其免疫標(biāo)記基因VSIG4的表達(dá)水平與乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)。VSIG4受上游miR-29a的調(diào)控發(fā)揮促癌作用。因此，VSIG4可能在腫瘤免疫浸潤中發(fā)揮重要作用，并可以作為乳腺癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。